310 10*1mm Ryðfrítt stál vafið rör efnahluti, N-enda lén spidroin mynda hydrogel byggt á amyloid fibrils og veita vettvang fyrir prótein immobilization.

Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Þú ert að nota vafraútgáfu með takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Að auki, til að tryggja áframhaldandi stuðning, sýnum við síðuna án stíla og JavaScript.
Rennistikur sem sýna þrjár greinar á hverri glæru.Notaðu til baka og næsta hnappa til að fara í gegnum glærurnar, eða rennibrautarhnappana í lokin til að fara í gegnum hverja glæru.

Forskrift

310 10*1mm Ryðfrítt stál spóla birgjar

Efnasamsetning

Vélrænir eiginleikar

Raðbrigða kónguló silki prótein (kónguló silki prótein) hafa marga möguleika í þróun nýrra lífefna, en margbreytileg og samloðandi eðli þeirra gerir það erfitt að fá þau og auðveld í notkun.Hér greinum við frá því að raðbrigða smækkuð spidroin prótein og, mikilvægur, N-enda lénið (NT) sjálft myndar fljótt sjálfbær og gagnsæ vatnsgel við 37 °C.samrunaprótein sem samanstanda af NT og grænu flúrljómandi próteini eða púrínnúkleósíðfosfórýlasa mynda fullvirkt samrunaprótein.Hydrogel.Niðurstöður okkar sýna að raðbrigða NT og samrunaprótein veita mikla tjáningarávöxtun og gefa vatnsgelum aðlaðandi eiginleika eins og gagnsæi, hlaupun án þvertengingar og beina hreyfingarleysi virkra próteina í miklum þéttleika.
Köngulær hafa allt að sjö mismunandi sett af silkikirtlum, sem hver framleiðir ákveðna tegund af silki.Allar sjö silkitegundirnar eru samsettar úr kónguló-silkipróteinum (spidroins) sem eru um það bil 6000 leifar að lengd og innihalda stórt miðlægt endurtekið svæði umkringt kúlulaga N- og C-enda lénum (NT og CT)1,2.Mest rannsakaða tegund silkis, aðal ampulla, er framleidd af aðal ampulla kirtli.Í þessum kirtli myndar einlag þekjufrumna spidroin prótein og seytir þeim inn í holrými kirtilsins, þar sem þau eru til staðar í leysanlegu formi (lyfjagjöf) í mjög háum styrk (30–50% w/v)3,4.Skipulag og lögun helstu ampullar spidroin próteina í kirtlinum hefur verið deilt, en flestar tilraunavísbendingar benda til þess að almennt spírulaga og/eða tilviljanakennd spidroin bygging og micellar eða lamellar uppbygging sé til staðar5,6,7,8,9,10.Þó að endurteknu lénin stjórni vélrænum eiginleikum silkitrefja, mynda β-lak nanókristalla og formlausa uppbyggingu11,12,13,14,15, stjórna endalén silkitrefjar sem svar við breyttum aðstæðum meðfram silkikirtlinum16,17,18.Með því að stjórna silkimyndun, 19. Endanleg lén varðveitast þróunarlega og virkni þeirra getur verið sameiginleg öllum spidroin próteinum 2,20,21.Við leið í gegnum kirtilinn lækkar sýrustig spidroins úr um 7,6 í < 5,716 og eykst við klippingu og teygju sem miðlað er af hreyfingu í gegnum smám saman þrengjanlegt rásina.Í lausn er CT α-heical constitutive parallel dimer17, en til að bregðast við lágu sýrustigi og skúfkrafti, þróast CT og skipta um β-lög16, 17, sem hugsanlega kallar á β-lög í endurteknum svæðum Convert 16. NT eru einliða undir aðstæður sem endurspegla aðstæður í holrými kirtilsins og miðla leysni spidroin, en við lækkað pH leiðir prótónun fjölda karboxýlsýru hliðarkeðja til dimerization NT með pKa um það bil 6,5, þar með stöðugleika NT og festa spidroin í stórum magni.net16,18.Þannig gegnir NT lykilhlutverki í myndun þráða og breytist úr einliða í húðinni í tvíliða í trefjum23,24,25.NT er enn mjög leysanlegt og spírallaga við allar aðstæður sem rannsakaðar hafa verið til þessa16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, sem hvatti til þróunar þess sem leysniaukandi merki til framleiðslu á ólíkum próteinum.
Raðbrigða smákónguló silkiprótein, sem samanstendur af einu NT, einu stuttu endurtekningarsvæði, einu CT og His6 merki (His-NT2RepCT) til hreinsunar, er jafnleysanlegt í vatnslausn og innfædd kónguló silkiprótein og líkir eftir innfæddum mikilvægum eiginleikum silkikóngulóar. .umfjöllun 25.31.His-NT2RepCT er hægt að spinna í samfelldar trefjar með lífhermivél þar sem pH 8 leysanlegt lag er pressað í pH 525,32,33,34,35 vatnsbað.Bioreactor gerjun á E. coli sem tjáir His-NT2RepCT og síðari eftirmeðferð leiddi til >14 g/L uppskeru eftir hreinsun.Hátt afrakstur, hár leysni og fullnægjandi svörun His-NT2RepCT við súr aðstæður eru öll rakin til NT23, 25, 34.
Hér greinum við frá hraðri myndun gagnsæra vatnsgella úr raðbrigðum spidroin próteinum, þar á meðal NT einu sér, með því að rækta próteinlausn við 37 °C.Með því að nota þíóflavín T flúrljómun (ThT), Fourier umbreytingu innrauða litrófsgreiningu (FTIR), kjarnasegulómun litrófsgreiningu (NMR) og rafeindasmásjá (TEM), komumst við að því að NT og örköngulóarprótein umbreytast í β-blöð og amyloid-líka þráða. þegar gel myndast.Að auki mynda samrunaprótein NT og grænt flúrljómandi prótein (GFP) eða púrín núkleósíð fosfórýlasa (PNP) vatnsgel með fullkomlega virkum samrunabrotum.Tjáning með mikilli afköstum í ólíkum hýslum, ásamt hraðri myndun vatnsgela við lífeðlisfræðilegar aðstæður, opnar möguleika á hagkvæmri framleiðslu á vatnsgelum með verkfræðilegri virkni.
Ólíkt flestum raðbrigða spidroin próteinum36 sem greint hefur verið frá, er His-NT2RepCT stöðugt í Tris-HCl jafnalausn við pH 8 og hægt að þétta allt að 500 mg/ml án útfellingar25.Þess vegna kom okkur á óvart að þetta prótein myndar fljótt sjóntært, sjálfbært vatnsgel þegar það var ræktað við 37°C (mynd 1b-d).Frekari rannsóknir sýndu að His-NT2RepCT hlaupun átti sér stað á breitt svið próteinstyrks (10-300 mg/mL) og að þessi styrkur var í öfugri fylgni við hlaupunartíma (mynd 1c og viðbótarmynd 1).Til að komast að því hvaða hlutar His-NT2RepCT miðla hýdrógelmyndun, skoðuðum við hvert lén fyrir sig og í ýmsum samsetningum með því að nota flöskusnúningspróf (mynd 1a, b).Öll prófuð brot af raðbrigða spidroin mynduðu hlaup (við próteinstyrk 300 mg/ml) á innan við 1 klst., nema útfelld 2Rep (mynd 1b).Þetta bendir til þess að NT og CT eitt sér, í samsetningu, eða í tengslum við endurtekningar, geti hlaupið við 37°C og að His6 merkið hafi ekki áhrif á þetta ferli að neinu marki.Í ljósi þeirrar almennu hugmyndar að NT sé mjög leysanlegt og stöðugt prótein, og að fyrri skýrslur um raðbrigða spidroin hýdrógel hafi rakið hlaupunaráhrif til breytinga á endurteknum svæðum og/eða CT, gæti NT sjálft það.Uppgötvun hlaupmyndunar var óvænt.Viðbótartafla 1) 37, 38, 39. Merkilegt nokk hefur NT hlaup þegar innan 10 mínútna í styrk ≥ 300 mg/ml (mynd 1c).Tilraunir í hettuglösum með mismunandi styrkleika NT sýndu að við >50 mg/ml hlaup NT lausnin hraðar en His-NT2RepCT við samsvarandi styrk (w/v, mynd 1c).
Skýringarmynd af ýmsum spidroin byggingum sem rannsakaðar eru í þessu verki.b Hlauptími við 37 °C fyrir ýmis raðbrigða spidroin prótein (300 mg/ml) staðfest með því að hvolfa hettuglasinu.CT hlaup strax án ræktunar (<300 mg/ml), 2Rep botnfall (300 mg/ml, 5 mm mælikvarði).c Hlauptími His-NT2RepCT og NT við tilgreindan próteinstyrk við 37°C.d Ljósmyndir af His-NT2RepCT og NT vatnsgellum með kóngulóinni og bókstafnum „NT“ prentað fyrir neðan, í sömu röð (bæði 200 mg/ml, mælikvarði 5 mm).
Vatnsgel sem myndast af ýmsum raðbrigðum spidroin próteinum hafa örlítið mismunandi lit og athugun með berum augum sýnir mismikla gagnsæi (mynd 1b).NT hlaup eru einstaklega glær á meðan önnur hlaup verða ógagnsæ.His-NT2RepCT og NT hlaup steypt í sívalur rör gæti verið fjarlægt úr mótinu heil (Mynd 1d).
Til að prófa hvort náttúruleg kónguló silki húðun geli við aðstæður sem nú hafa reynst valda hlaupi á raðbrigða spidroin próteinum, var húðun safnað úr stóra ampulla kirtlinum sænsku brúarkóngulóarinnar (Larinioides sclopetarius).Húðun var geymd í 20 mM Tris-HCl jafnalausn við 50 mg/ml (miðað við mælda þurrþyngd), en engin hlaup sást á 21 daga ræktuninni við 37 °C (viðbótarmynd 2a).
Til að magngreina þessar gel er hægt að nota gigtarmælingar til að rannsaka hlaupunarferlið og ákvarða heildar vélrænni eiginleika.Sérstaklega getur eftirlit með geymslustuðul (teygni) við hækkað hitastig veitt upplýsingar um hlauphitastigið sem og seigjaeiginleika húðarinnar.Tilraunir til að hækka hitastig (með því að nota 1°C/mín við 25-45°C, byggt á fyrri rannsóknum með náttúrulegum silkistofnlausnum)40,41 sýndu að geymsluþol His-NT2RepCT og NT lausna jókst með hækkandi hitastigi.var aukin (mynd 2 og aukamynd 3).Sérstaklega byrjaði NT-einingin að vaxa við lægra hitastig samanborið við His-NT2RepCT, í samræmi við hraðari hlauptíma sem sést þegar NT var ræktað beint með His-NT2RepCT við 37°C (Mynd 1).Eftir síðari hitafall fór geymslustuðullinn ekki aftur í lægri gildi og hélst fyrir ofan tapstuðulinn (sjá viðbótarmynd 3), sem gefur til kynna hitafræðilega óafturkræfa stöðuga hlaup.Eftir hlaup var endanlegur teygjustuðull á bilinu 15 til 330 kPa fyrir His-NT2RepCT vatnsgel í styrkleika 100–500 mg/ml og endanlegur teygjustuðull fyrir NT vatnsgel (100–500 mg/ml) á bilinu 2 til 1400 kPa (mynd , 2 og heill rampagögn) sjá aukamynd 3).
a Breyting á hitastigi við mælingar á His-NT2RepCT (300 mg/ml) og b NT (300 mg/ml) með hristingu.Örvarnar gefa til kynna hitastigsþróunina og ljósari skygging gagnageymslueiningar sýnir prófun við lægri toggildi fyrir tækið en framleiðandinn tilgreinir, sem er orsök aukins hávaða.c Uppsöfnun á lokaeiningar His-NT2RepCT og NT eftir hækkað hitastig (100, 300 og 500 mg/ml).Allar mælingar á einingum eru teknar á tíðninni 0,1 Hz.
Sem hugsanleg aðferð til að rannsaka breytingabreytingar í tengslum við hlaup, skráðum við FTIR litróf His-NT2RepCT og NT fyrir og eftir hlaup við 37 ° C (mynd 3a, b).Eins og búist var við samsvaraði litróf His-NT2RepCT og NT lausna próteinum sem sýndu α-helix/handahófskennda spólubyggingu, með áberandi bandi við 1645 cm-1.Fyrir báðar vatnsgellan leiddi hlaupið til þess að tveir armar mynduðust í miðju I bandinu við um 1617 cm-1 og 1695 cm-1 (mynd 3a, b), sem gefur til kynna myndun andhliða β-lagsbygginga.Þessar breytingar má einnig sjá greinilega í viðkomandi annarri afleiðu og mismuna hlauparrófinu (aukamynd 4b).Tvær bönd NT β-lagsins voru meira áberandi en His-NT2RepCT, sem gefur til kynna að heildarinnihald β-laga böndanna í NT hýdrógelinu hafi verið hærra en NT2RepCT hýdrogelsins.
FTIR frásogsróf His-NT2RepCT og b NT (bæði 500 mg/mL) fyrir (lausn) og eftir (hlaup) ræktun við 37°C.c TEM myndir af endurblönduðum 50 mg/ml NT2RepCT hlaupum og d NT.Skalastöng 200 nm.e Trefjaþvermál His-NT2RepCT og NT hydrogel.n = 100 mældar fibrils, p < 0,0001.Villustikurnar sýna staðalfrávikið.Miðja villustikanna er meðaltalið.Óparað t-próf ​​(tvíhliða) var notað til tölfræðilegrar greiningar.f ThT flúrljómun ýmissa raðbrigða spidroin próteina (100 mg/ml) við 37 °C án þess að hrista.g NT (100 mg/ml) sáningartilraunir úr 100 mg/ml NT hlaupi með 0%, 5%, 10% og 20% ​​fræjum.
Greining á hlaupinu með rafeindasmásjá (TEM) sýndi að vatnsgelið samanstendur af amyloid-líkum þráðum (myndir 3c, 3d).NT-mynduð fibrils voru ílangar (5-12 nm í þvermál) og ógreinóttar, en His-NT2RepCT fibrils voru styttri á lengd og marktækt breiðari í þvermál (7-16 nm) (Mynd 3e).Þessar niðurstöður gerðu okkur kleift að fylgjast með hreyfihvörfum bandvefsmyndunar með því að nota thioflavin T (ThT) prófið.Fyrir öll raðbrigða spidroin prótein jókst flúrljómunarmerkið þegar sýni voru ræktuð við 37 °C (mynd 3f, aukamynd 5a).Í samræmi við þessa niðurstöðu leiddi smásjárrannsókn á NT og His-NT2RepCT við hlaupandi aðstæður í ljós samræmda aukningu á ThT flúrljómun án merkjanlegrar staðbundinnar uppsöfnunar ThT-jákvæðra efna (viðbótarmynd. 5b, c).Myndun ThT-jákvæðra fibrilla fylgdi ekki aukning á NT og His-NTCT gruggi (viðbótarmynd 5d), sem þýðir að net af fibrils í hlaupinu gæti myndast án þess að skerða hlaupskýrleikann.Sáning með því að bæta við litlu magni af formynduðum trefjum getur hraðað verulega myndun sumra amyloids42,43,44 en að bæta 5%, 10% eða 20% (w/w) NT við lausn af NT vatnsþynningarefnum.sáningaráhrif (mynd 3g).Kannski er þetta vegna þess að fibril í hydrogelinu eru tiltölulega fast og ekki hægt að nota sem fræ.
Óvænt hegðun raðbrigða spidroin próteina við háan hita olli frekari rannsóknum á kjarnasegulómun (NMR) litrófsrannsóknum til að bera kennsl á sköpulagsbreytingar sem tengjast hlaupmyndun.NMR litróf His-NT2RepCT lausna sem skráðar voru með tímanum við 37°C sýndu að CT var enn brotið að hluta, en NT og 2Rep merki voru horfin (mynd 4a), sem bendir til þess að það hafi aðallega verið NT og 2Rep sem stýrði að hluta til myndun His- NT2RepCT hýdrogel.CT-merkið var einnig veikt niður í 20% af upprunalegum styrkleika þess, sem bendir til þess að CT sé einnig að mestu fast og fellt inn í hydrogel uppbygginguna.Fyrir minni hluta CT, sem er eins hreyfanlegur og í forræktaða sýninu og sést þannig með lausn NMR, skortir litróf merki fyrir fyrstu 10 uppbyggðu leifarnar, hugsanlega vegna erfiðrar óhreyfingar á tengdum hluta His-NT2Rep .NMR litróf -ástands vatnsgella -NT2RepCT leiddi í ljós ríkjandi nærveru α-helices og β-laga og, í minna mæli, tilviljunarkennda spólubyggingu (mynd 4b).Efnafræðileg breyting á metíónínleifum sem eru aðeins til staðar í NT sýndi að þessu léni hafði verið breytt í β-blaðsbyggingu.Tímaháð litróf NT í lausn sýndi samræmda lækkun á merkistyrk (Mynd 4c), og solid-state NMR af NT hydrogelum sýndi að flestum NT leifum var breytt í β-blaðsbyggingar (Mynd 4d).Ekki var hægt að ákvarða sköpulag 2Rep sérstaklega vegna tilhneigingar þess til að safnast saman.Hins vegar leit NMR litróf NTCT og His-NT2RepCT hýdrógelanna mjög svipað út (mynd 4b; viðbótarmynd 6b), sem bendir til þess að 2Rep hafi lítið stuðlað að byggingarhluta His-NT2RepCT hýdrógelsins.Fyrir CT-hýdrógel, reyndust α-helices, β-blöð og tilviljunarkenndar efri efri uppbyggingar (aukamynd. 6d).Þetta bendir til þess að sumir hlutar CT haldist α-helices á meðan aðrir verða β-blöð.Þannig benda niðurstöður NMR litrófsgreiningar til þess að NT sé mikilvægt fyrir vatnshlaupsmyndun og umbreytist einnig í β-blaðsbyggingu við samruna við 2Rep og CT.Í samræmi við þetta komumst við nýlega að því að amyloid staðbundin rennilás myndast líklega í öllum fimm þyrlum NT lénsins og Waltz reikniritið spáði fyrir um amyloidogenic svæði í helix 1 (Mynd 4e).
2D litróf 15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT lausn fyrir (blá) og 19 klukkustundum eftir ræktun (rauð) við 37°C.Einstakir krosstoppar í rauða litrófinu og F24, G136, polyA í bláa litrófinu eru táknaðir með einsbókstafa amínósýrutáknum og efnaleifanúmerum.Innfellingarnar sýna hversu háð merki styrkleiki er á réttum tíma fyrir valda leifar úr NT, 2Rep og CT lénunum.b Solid-state radiofrequency (RFDR) litróf His-NT2RepCT hydrogel.Fylgni Cα/Cβ leifa sem sést í RFDR litrófum voru ákvörðuð með samanburði við líkan peptíðefnabreytinga og gildi sem fengin eru úr tölfræði82,83 og efri byggingu þeirra.SSB – snúningshliðarband.c Einvídd litróf 15N-HSQC 10 mg/mL NT lausnar meðan á ræktun stendur við 37 °C í 36 klst.Innfellingin sýnir rúmmálsstyrk á móti tíma.d RFDR litróf í föstu formi NT hydrogela.Fylgni Cα/Cβ leifa og aukabyggingar þeirra sem sést í RFDR litrófinu eru sýndar.e Byggt á NT45.79 fibrillation tilhneigingu prófílnum úr Zipper gagnagrunninum (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Rosetta orka staðbundins eldingavaktarglugga hexapeptíðsins er sýnd í kcal/mól.Rauðar súlur tákna hexapeptíð með mikla bandvefshneigð (Rosetta orka undir -23 kcal/mól; fyrir neðan punktalínu).Grænar súlur gefa til kynna brot með Rosetta orku fyrir ofan þröskuldinn og því ólíklegri til að mynda steríska rennilása.Brot sem innihéldu prólín voru útilokuð frá greiningunni (án súlna).Ferningar gefa til kynna svæði amyloidosis sem spáð er af Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).Röð amínósýruleifa NT er efst og þær tegundir leifa sem finnast í β efri uppbyggingu (ákvarðað með NMR litrófsgreiningu á föstu formi) eru sýndar í rauðu.Staðsetningar fimm NT α-heilanna eru merktar (H1-H5)28.
Við pH <6,5 dimeríser HT og er ónæmt fyrir hita- eða þvagefni af völdum eðlisbreytingar18.Til að skýra hvernig NT dimerization og stöðugleiki hafa áhrif á hlaup, var lausnum sem innihéldu 100 mg/ml NT stýrt við pH 8, 7 og 6 með því að nota prófun á hettuglasinu.NT sýni sem voru ræktuð við pH 8 og 7 gelpuðu eftir 30 mínútur við 37 °C, en pH 8 hlaupið hélst tært, en pH 7 hlaupið sýndi sýnilegt botnfall (mynd 5a).Aftur á móti myndaði lausn sem innihélt HT við pH 6 ekki hlaup og mikið botnfall sást eftir 20 mínútur við 37°C.Þetta bendir til þess að dimerar sjálfar og/eða meiri stöðugleiki þeirra samanborið við einliða komi í veg fyrir hlaup.Ekki var búist við myndun botnfalls fyrir NT við pH 7 og 6, þar sem greint hefur verið frá því að NT er leysanlegt við 200 mg/ml27, brotnar auðveldlega saman aftur eftir varmaeðlun og heldur einnig α-helix við lægri gildi pH 18. Líkleg skýring á þessu misræmi er sú að áður greindar tilraunir voru gerðar við stofuhita eða undir, eða við tiltölulega lágan próteinstyrk16,18,19.
NT hettuglas snúningspróf (100 mg/ml) við pH 8, 7, 6 og 154 mM NaCl (pH 8) eftir ræktun við 37°C.b NT CD litróf með og án 154 mM NaF og 154 mM NaCl, í sömu röð.Mólsporvölustig við 222 nm er breytt í hlutfall náttúrulegra fellinga.c NT snúningspróf (100 mg/ml) NT* (37 °C og 60 °C), NTA72R (37 °C) og His-NT-L6 (37 °C og 60 °C).d CD litróf NT stökkbreyttra NT*, NTA72R og His-NT-L6.Mólsporvölustig við 222 nm er breytt í hlutfall náttúrulegra fellinga.e Inversion próf á NTFlSp, NTMiSp og minnkað NTMiSp (100 mg/ml).Skalastöng 5 mm.f CD litróf NT, NTFlSp, NTMiSp og minnkað NTMiSp.Mólsporvölustig við 222 nm er breytt í hlutfall náttúrulegra fellinga.Full NT litróf við 25 °C og 95 °C eru sýnd á aukamynd 8.
Lífeðlisfræðileg saltstyrkur ákvarðar rafstöðueiginleikar milli NT undireininga og dimerization NT flutnings í lægra pH18.Við komumst að því að tilvist 154 mM NaCl og NaF hamlaði sannarlega hlaupmyndun, hvort um sig (mynd 5a, b; aukamynd 2b) og að þessi sölt jók hitastöðugleika NT einliða (mynd 5b, viðbótarmynd 8). .Það bendir einnig til þess að aukinn stöðugleiki, frekar en dimmerization, komi í veg fyrir hlaupmyndun.
Til að kanna frekar hlutverk próteindímerunar og stöðugleika í hlaupmyndun, notuðum við tvö stökkbrigði, NT* og NTA72R, sem einnig eru einliða við lágt pH28,30.NT* er stökkbreytt tvíhleðsluviðsnúningur þar sem augljós tvískauta hleðsludreifing einliða er fletjað út, sem kemur í veg fyrir tvískiptingu og eykur verulega stöðugleika einliða.NTA72R er hlaðinn tvípólur, en Arg-setur Ala er staðsettur við dimera mörkin, þannig að stökkbreytingar trufla milliverkun undireininga sem þarf til að tvískipta.Við ræktun við 37°C myndaði NT* ekki vatnsgel á meðan NTA72R myndaði ógegnsætt hlaup í 15 mínútur (mynd 5c).Þar sem bæði NT* og NTA72R geta ekki dimerized en mismunandi í einliða stöðugleika (Mynd. 5d), þessar niðurstöður benda eindregið til þess að hár varmafræðilegur stöðugleiki kemur í veg fyrir NT frá hlaup.Þetta er einnig stutt af því að HT* myndar hlaup þegar það er óstöðugt við háan hita (eftir 8 mín við 60°C; mynd 5c).Áður hefur verið sýnt fram á að hátt innihald metíóníns í NT gerir náttúrulega brotun þess fljótandi og að sex Met til Leu staðgenglar (hér nefnt His-NT-L6) koma NT46 einliðanum mjög á jafnvægi.Byggt á þeirri forsendu að byggingarsveigjanleiki sé nauðsynlegur fyrir NT hlaupmyndun, komumst við að því að His-NT-L6 stöðuga stökkbrigðin hlaupi ekki við 37 °C (Mynd 5c, d).Hins vegar myndaði His-NT-L6 einnig hlaup við ræktun við 60°C í 60 mínútur (mynd 5c).
Hæfni NT til að umbreytast í β-blaðsbyggingar og mynda vatnsgel virðist eiga við um sum en ekki öll NT lén spidroin.NTs frá mismunandi silkitegundum og köngulóategundum, Trichonephila clavipes (NTFlSp), mynduðu hlaup þrátt fyrir tiltölulega lágt metíónín innihald og mikinn hitastöðugleika (mynd 5e, f og viðbótartafla 2).Aftur á móti myndaði NT frá litla ampullar próteininu spidroin frá Araneus ventricosus (NTMiSp) með lágan hitastöðugleika og hátt metíónín innihald ekki vatnsgel (aukatafla 2 og mynd 5e, f).Hið síðarnefnda gæti tengst nærveru tvísúlfíðtengja innan sameinda29,47.Í samræmi við það, þegar tvísúlfíðtengi NTMiSp voru minnkuð, myndaði það hýdrógel eftir ræktun við 37°C í 10 mínútur (mynd 5e).Að lokum skal tekið fram að burðarvirki sveigjanleiki er mikilvæg, en ekki eina, viðmiðunin fyrir myndun hlaups frá NT.Annar þáttur sem gæti skipt máli er tilhneigingin til að mynda amyloid fibrils og greining með rennilásgagnagrunninum og Waltz reikniritinu sýndi fylgni á milli getu til að mynda gel og tilvist amyloidogenic svæða, sem og umfang svæða sem spáð var fyrir um. til að mynda steríska rennilása.Það var fylgni (aukatafla 2 og aukamynd 9).
Hæfni NT til að mynda fibrils og mynda hlaup við hagstæðar aðstæður leiddi til þess að við gerðum tilgátu um að NT samruni við önnur próteinbrot geti samt myndað gel með fullri virkni samrunafélaga.Til að prófa þetta, kynntum við grænt flúrljómandi prótein (GFP) og púrín núkleósíð fosfórýlasa (PNP) í C-enda NT, í sömu röð.Samrunapróteinin sem mynduðust voru tjáð í E. coli með mjög háum lokauppskeru (150 mg/L og 256 mg/L hristiflöskurækt fyrir His-NT-GFP og His-NT-PNP, í sömu röð), í samræmi við það sem hefur verið sýnt fram á. fyrir Önnur prótein sameinuð við NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/ml) og His-NT-PNP (100mg/ml) samrunaprótein mynduðu hlaup eftir 2 klukkustundir og 6,5 klukkustundir við 37°C og, mikilvægara, var GFP-hlutinn óbreyttur.sást eftir hlaup, með >70% af upphafsflúrljómunarstyrknum eftir eftir hlaup (mynd 6a).Til að mæla PNP virkni í his-NT-PNP lausnum og hlaupum, þurftum við að þynna samrunapróteinið með NT vegna þess að ensímvirkni hreina efnablöndunnar var utan greiningarsviðs prófunar við hlaupstyrk.Hlaupið sem var myndað með blöndu sem innihélt 0,01 mg/ml His-NT-PNP og 100 mg/ml NT hélt 65% af upphaflegri ensímvirkni forræktuðu sýnanna (mynd 6b).Gelið hélst ósnortið meðan á mælingu stóð (aukamynd 10).
a Hlutfallslegur flúrljómunarstyrkur fyrir og eftir hlaup á His-NT-GFP (300 mg/ml) og hvolfi hettuglasi sem inniheldur His-NT-GFP hydrogel (300 mg/ml) undir sýnilegu og útfjólubláu ljósi.Punktar sýna einstakar mælingar (n = 3), villustikur sýna staðalfrávik.Meðalgildið er sýnt í miðju villusúlunnar.b PNP virkni var fengin með flúormælingu með því að nota lausnir og gel sem samanstóð af NT (100 mg/ml) og blöndu sem innihélt 0,01 mg/ml his-NT-PNP og 100 mg/ml New Taiwan dollara.Innfellingin sýnir hvolft hettuglas sem inniheldur hýdrógel sem inniheldur His-NT-PNP (5 mm kvarðastöng).
Hér greinum við frá myndun hydrogela úr NT og öðrum raðbrigðum spidroin próteinum með því að rækta próteinlausn við 37°C (Mynd 1).Við sýnum að hlaupun tengist umbreytingu α-helices í β-lög og myndun amyloid-líkra fibrilla (myndir 3 og 4).Þessi niðurstaða kemur á óvart þar sem NT eru spóluð kúlulaga fimm helix knippi þekkt fyrir mjög mikla leysni og mikinn stöðugleika við styrk >200 mg/ml við 4°C í nokkra daga27.Að auki brjóta NTs auðveldlega saman aftur eftir hitaeðlun við lágan próteinstyrk í µM.Samkvæmt niðurstöðum okkar krefst myndun fibril samsetningar >10 mg/mL próteinstyrks og örlítið hækkaðs hitastigs (mynd 1).Þetta er í samræmi við þá hugmynd að amyloid fibrils geti myndast úr kúlubrotnum próteinum sem eru í óbrotnu ástandi að hluta vegna hitasveiflna við lífeðlisfræðilegar aðstæður 48 .Dæmi um prótein sem gangast undir þessa umbreytingu eru insúlín49,50, β2-microglobulin, transthyretin og lysozyme51,52,53.Þrátt fyrir að NT sé α-helix í upprunalegu ástandi, er um það bil 65% af fjölpeptíðkeðjunni samhæft við sterísk rennilásmyndun (mynd 4e) 45 .Þar sem einliðan er hreyfanleg hreyfanleg46 getur hún afhjúpað þessi hugsanlegu amyloidogenic svæði við miðlungs hátt hitastig og við háan styrk heildarpróteins getur hún náð mikilvægum styrk fyrir myndun amyloid fibril54.Í kjölfar þessarar röksemdafærslu fundum við neikvæða fylgni milli styrks spidroin og hlaupunartíma (mynd 1c), og ef einliða NT myndunin er stöðug annaðhvort með stökkbreytingum (NT*, His-NT-L6) eða með salti viðbót, getur komið í veg fyrir að myndun vatnsgel (mynd 5).
Í flestum tilfellum hverfa amyloid fibrils úr lausn sem botnfall, en við ákveðnar aðstæður geta þær myndað vatnsgel55,56,57.Hydrogel-myndandi fibrils hafa venjulega hátt stærðarhlutfall og mynda stöðug þrívíddarnet í gegnum sameindaflækju, 55,58 í samræmi við niðurstöður okkar.Fyrir hydrogel myndun in vitro eru prótein oft óbrotin að fullu eða að hluta, td við útsetningu fyrir lífrænum leysum, háum hita (70–90°C) og/eða lágu pH (1,5–3,0)59,60,61,62.Spidroin-hýdrógelin sem lýst er hér krefjast ekki harðrar vinnslu, né krefjast þvertengingarefna til að koma á stöðugleika í vatnsgelunum.
Áður hefur verið greint frá því að spidroin endurtekningar og QDs, sem virðast gangast undir β-blaðaskipti við silkisnúning, mynda vatnsgel.Í samanburði við niðurstöður okkar voru ræktunartímar og/eða ræktunarhitastig marktækt lengri eða hærri, í sömu röð, og vatnsgelin sem mynduðust voru oft ógagnsæ (Mynd 7 og viðbótartafla 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Til viðbótar við hraðan hlauptíma, voru NT vatnsgel >300 mg/ml (30%) betri en öll önnur lýst raðbrigða kónguló silki prótein hýdrógel, sem og náttúruleg vatnsgel eins og gelatín, algínat (2%), agar (0,5% ) og kollagen.(0,6%) (Mynd 7 og aukatöflur 1 og 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Hlauptími og mýktarstuðull vatnsgelanna í þessari rannsókn var borinn saman við önnur spídroin-undirstaða vatnsgel og valin náttúruleg vatnsgel.Tilvísanir eru gefnar ásamt lýsingu á hlaupunarskilyrðum.APS Ammóníumpersúlfat, stofuhita.Gögn 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Köngulær virðast hafa þróað leiðir til að koma í veg fyrir að spidroin hlaupi við geymslu.Þrátt fyrir háan styrk próteina í silkikirtlinum þýðir stóra endurtekningarsvæðið sem tengist endasvæðinu að sýnilegur styrkur NT og CT í kirtlinum samsvarar um það bil 10-20 mg/ml, við mörk þessarar rannsóknar.sem þarf til að sjást hýdrógelmyndun in vitro.Að auki stöðvaði svipaður styrkur salta 16 NT, eins og í silkikirtlum (mynd 5b).NT sköpulag hefur verið rannsökuð í E. coli umfrymis og reynst vera þéttari brotin en þegar hún er skoðuð in vitro, sem bendir enn frekar til þess að salt eða aðrir þættir koma í veg fyrir samloðun þess in vivo.Hins vegar getur hæfni NTs til að umbreytast í β-sheet fibrils verið mikilvæg fyrir þráðamyndun og ætti að rannsaka í framtíðarrannsóknum.
Til viðbótar við nýja þætti NT-amyloid-eins og fibril og hydrogel myndun sem fram kom í þessari rannsókn, sýnum við einnig að þetta fyrirbæri gæti haft líftækni og líflæknisfræðilega notkun (mynd 8).Sem sönnun fyrir hugmyndinni sameinuðum við NT við GFP eða PNP og sýndum að samrunapróteinið myndar einnig vatnsgel þegar það er ræktað við 37 °C og að GFP og PNP brotin halda að mestu leyti virkni sinni eftir hlaup (Mynd 6).Núkleósíð fosfórýlasar eru mikilvægir hvatar til að mynda núkleósíð hliðstæður75, sem gerir uppgötvun okkar viðeigandi fyrir líflyfjaiðnaðinn.Hugmyndin um að tjá samrunaprótein sem mynda gagnsæ vatnsgel við hagstæðar aðstæður gerir kleift að búa til hagnýt vatnsgel með hagstæðum eiginleikum fyrir margs konar notkun eins og ensímstöðvun, stýrða lyfjalosun og vefjaverkfræði.Að auki eru NT og NT* skilvirk tjáningarmerki30, sem þýðir að hægt er að nota NT og afbrigði þess til framleiðslu á uppleysanlegum samrunapróteinum með miklum afköstum og í kjölfarið myndun óhreyfðra markpróteina í þrívíddarhýdrógelum.
NT er leysanlegt, α-helix og stöðugt við lágan styrk (µM) og 37°C.Við sama hitastig, en í auknum styrk (>10 mg/ml), myndar NT hlaup sem samanstanda af amyloid-líkum fibrils.NT samrunaprótein mynda einnig fibrillar gel með fullkomlega virkum samrunabrotum, sem gerir kleift að festa ýmis prótein í 3D vatnsgellum með því að nota NT.Neðst: NT (PDB: 4FBS) og skýringarmyndir af trefjanetum og tengdum próteinbyggingum (gert ráð fyrir og ekki teiknað í mælikvarða, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ).
Smíðin (sjá viðbótartöflu 4 fyrir heildarlista þar á meðal amínósýruraðir) voru klónaðar inn í plasmíð pT7 og umbreytt í E. coli BL21 (DE3).E. coli sem innihélt verkræn plasmíð voru sáð í Luria seyði ásamt kanamýsíni (70 mg/l) og ræktað yfir nótt við 30°C og 250 snúninga á mínútu.Ræktin var síðan sáð 1/100 í LB miðil sem innihélt kanamýsín og ræktuð við 30°C og 110 rpm þar til OD600 náði 0,8.Fyrir NMR rannsóknir voru bakteríur ræktaðar í M9 lágmarksmiðli sem innihélt 2 g af D-glúkósa 13C (Aldrich) og 1 g af ammóníumklóríði 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) fyrir próteinmerkingar með samsætum.Lækkið hitastigið í 20 gráður á Celsíus og framkallið próteintjáningu með 0,15 mM ísóprópýlþíógalaktópýranósíði (endastyrkur).Eftir próteintjáningu yfir nótt voru frumur safnað við 7278×g, 4°C í 20 mín.Frumukögglar voru endurblandaðir í 20 mM Tris-HCl, pH 8, og frystir þar til þeir eru notaðir frekar.Þíðaðar frumur voru ljósaðar með því að nota frumutruflandi (TS röð vélar, Constant Systems Limited, Englandi) við 30 kPa.Síðan voru lýsötin skilin í skilvindu við 25.000 g í 30 mínútur við 4°C.Fyrir NTMiSp var kögglan síðan endurleyst í 2 M þvagefni, 20 mM Tris-HCl, pH 8, og hljóðbeitt í 2 mínútur (2 s kveikt/slökkt, 65%), síðan skilið aftur við 25.000 xg, 4°C. 30 mín.Fljótandi vökvinn var settur á Ni-NTA súlu, þvegin með 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazoli, pH 8, og að lokum var próteinið skolað út með 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazoli, pH 8. Til að mynda NT2RepCT og NTCT, trombínmelting kynnir staðinn (ThrCleav) á milli His og NT.Thrombin klofningsstaðir eru einnig til staðar í His-NT-ThrCleav-2Rep (framleiðir 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (framleiðir NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (framleiðir CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (framleiðir NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (framleiðir NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (framleiðir NTF1Sp), og His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (framleiðir NTMiSp).Smíðin voru melt með þrombíni (1:1000) og skiluð yfir nótt við 4°C með 20 mM Tris-HCl, pH 8, með því að nota Spectra/Por skilunarhimnu með mólþungaþröskuld 6-8 kDa.Eftir skilun er lausninni hlaðið á Ni-NTA súlu og frárennslisvatninu sem inniheldur próteinið sem vekur áhuga er safnað saman.Próteinstyrkur var ákvarðaður með því að mæla útfjólubláa gleypni við 280 nm með því að nota útrýmingarstuðul hvers próteins, nema NTF1Sp, sem notaði Bradford prófið í samræmi við siðareglur framleiðanda.Hreinleiki var ákvarðaður með SDS pólýakrýlamíði (4–20%) gel rafdrætti og Coomassie brilliant blue litun.Prótein voru þétt með því að nota skilvindusíur (VivaSpin 20, GE Healthcare) við 4000 xg með 10 kDa mólþyngdarskerðingu í 20 mínútna lotum.
Þiðið próteinlausnina og píptu varlega 150 µl í 1 ml glært skilrúmshettuglas (8 x 40 mm Thermo Scientific).Glösin voru lokuð og innsigluð með parafilmu til að koma í veg fyrir uppgufun.Sýni (n = 3) voru ræktuð við 37°C eða 60°C og hvolft reglulega til að sjá hlaup.Sýni sem ekki hlaup voru ræktuð í að minnsta kosti eina viku.Dragðu úr NTMiSp tvísúlfíðtengjum með 10 mM DTT á 10 µM prótein.Til að greina hlaup náttúrulegs kóngulósilkihúðunar var sænska brúarkóngulóin skorin, tveir aðal kirtlarnir, sem voru í upptöku, voru settir í 200 μl af 20 mM Tris-HCl jafnalausn pH 8 og skornir til að leyfa húðinni að skiljast frá kirtlunum..Innihald kirtlanna er leyst upp í jafnalausn, 50 µl til að ákvarða þurrþyngd (með ræktun á opnum hettuglösum við 60 °C til stöðugrar þyngdar) og 150 µl fyrir hlaup við 37 °C.
Mælirúmfræðin/tólið er úr ryðfríu stáli með samhliða plötu með 20 mm þvermál efst og 0,5 mm bil.Hitið sýnið úr 25 °C til 45 °C og aftur í 25 °C með hraðanum 1 °C á mínútu með því að nota Peltier-plötu með botni úr ryðfríu stáli.Titringsmælingar voru gerðar á tíðninni 0,1 Hz og á línulegu seigjuteygjusvæði efnisins við álag upp á 5% og 0,5% fyrir sýni upp á 100 mg/mL og 300–500 mg/mL, í sömu röð.Notaðu sérsniðið rakahólf til að koma í veg fyrir uppgufun.Gögnin voru greind með Prisma 9.
Til að safna innrauðum (IR) litrófum við stofuhita frá 800 til 3900 cm–1.ATR tækið, sem og ljósleið í gegnum litrófsmælirinn, er hreinsað með þurru síuðu lofti fyrir og meðan á tilrauninni stendur.Lausnir (500 mg/ml til að lágmarka vatnsupptökutinda í litrófinu) voru pípettaðar á kristallana og hlaup (500 mg/ml) mynduð fyrir mælingu og síðan flutt yfir í kristallana (n = 3).1000 skannar voru skráðar með upplausninni 2 cm-1 og núllvinnulotu upp á 2. Önnur afleiðan var reiknuð með OPUS (Bruker) með því að nota níu punkta sléttunarsvið.Litrófið var staðlað á sama samþættingarsvæði á milli 1720 og 1580 cm-1 með því að nota F. Menges „Spectragryph – Optical Spectroscopy Software“.Í ATR-IR litrófsgreiningu er skarpskyggni dýpt innrauðs geisla inn í sýni bylgjutöluháð, sem leiðir til sterkara frásogs við lægri bylgjutölur en við hærri bylgjutölur.Þessi áhrif hafa ekki verið leiðrétt fyrir litrófið sem sýnt er á myndum.3 vegna þess að þau eru mjög lítil (aukamynd 4).Leiðrétt litróf fyrir þessa mynd voru reiknuð út með Bruker OPUS hugbúnaðinum.
Í grundvallaratriðum er yfirgripsmikil magngreining á prótínsköpum möguleg eftir áreiðanlega afmyndun efnisþáttanna innan amíð I toppsins.Hins vegar koma nokkrar hindranir í framkvæmd.Hávaði í litrófinu getur birst sem (falskir) toppar meðan á affellingu stendur.Þar að auki fellur toppurinn vegna vatnsbeygju saman við stöðu amíð I toppsins og getur verið svipaður stærð fyrir sýni sem innihalda mikið magn af vatni, eins og vatnskennda hlaupið sem rannsakað er hér.Þess vegna reyndum við ekki að brjóta niður amíð I toppinn að fullu og athuganir okkar ættu aðeins að líta til stuðnings öðrum aðferðum eins og NMR litrófsgreiningu.
Lausnir af 50 mg/ml NT og His-NT2RepCT voru hlaupnar yfir nótt við 37°C.Vatnsgelið var síðan þynnt með 20 mM Tris-HCl (pH 8) í styrkleikann 12,5 mg/ml, hrist vel og pípettað til að brjóta hlaupið.Því næst var hýdrógelið þynnt 10 sinnum með 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl af sýninu sett á koparrist húðað með formvar og umframsýni fjarlægt með þekjupappír.Sýni voru þvegin tvisvar með 5 µl af MilliQ vatni og lituð með 1% úranýlformati í 5 mínútur.Fjarlægðu umfram bletti með ísogandi pappír og loftþurrkaðu síðan möskvann.Myndataka var framkvæmd á þessum ristum með því að nota FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN sem starfaði við 100 kV.Myndirnar voru teknar upp í x 26.500 og x 43.000 stækkun með Veleta 2k × 2k CCD myndavél (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Þýskalandi).Fyrir hvert sýni (n = 1) voru teknar 10–15 myndir.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) var notað við myndgreiningu og mælingu á þvermál trefja (n = 100, mismunandi trefjar).Prisma 9 var notað til að framkvæma ópöruð t-próf ​​(tvíhliða).Meðaltal His-NT2RepCT og NT fibrils voru 11,43 (SD 2,035) og 7,67 (SD 1,389) nm, í sömu röð.Öryggisbilið (95%) er -4,246 til -3,275.frelsisgráður = 198, p < 0,0001.
80 µl af vökvasýnum sem innihéldu 10 µM thioflavin T (ThT) voru mældir í þríriti (n = 3) við kyrrstæðar aðstæður með því að nota Corning 96-brunn svartbotna glæra botnplötur (Corning Glass 3881, USA).Flúrljómunarmunur var skráður með því að nota 440 nm örvunarsíu og 480 nm útblásturssíu (FLUOSTar Galaxy frá BMG Labtech, Offenburg, Þýskalandi).ThT merkið var hvorki mettað né slökkt, þar sem tilraunir með mismunandi styrk ThT voru gerðar án þess að breyta merki styrkleika.Skráðu gleypni við 360 nm til að mæla þoku.Fyrir sáningartilraunir voru 100 mg/ml hlaup mynduð við 37°C, endurblönduð og notuð til sáningar í mólhlutföllum 5%, 10% og 20%.Gögnin voru greind með Prisma 9.
Þíða stofna af His-NT2RepCT og NT >100 mg/ml á ís og sía í gegnum 0,22 µm síu.Styrkur var reiknaður út með því að mæla gleypni við 280 nm með Nanodrop.Í holum á 96 brunna svartri óbindandi plötu (Corning) með glærum botni voru sýni þynnt í 20 mg/ml í 20 mM Tris-HCl pH 8 og blandað saman við 5 μM ThT (endastyrkur), heildarstyrkur sýnis. 50 μl rúmmál.Sýni voru mynduð á 10 mínútna fresti við 37 °C á CellObserver (Zeiss) smásjá með sendri ljósrás og FITC örvunar- og losunarsíusettum fyrir ThT myndgreiningu.Til myndatöku er notuð 20x/0,4 linsa.Zen Blue (Zeiss) og ImageJ (https://imagej.nih.gov/) voru notuð við myndgreiningu.Gel voru einnig framleidd úr NT og His-NT2RepCT lausnum í styrkleikanum 50 mg/ml sem innihéldu 20 mM Tris pH 8 og 5 µM ThT og ræktuð við 37°C í 90 mínútur.Gelbitarnir voru fluttir í nýjan brunn sem innihélt 20 mM Tris, pH 8 og 5 μM ThT í óbindandi svartri 96 brunna glærri botnplötu.Fáðu græna flúrljómun og myndir af björtum sviðum við 20x/0,4 stækkun.ImageJ var notað til myndgreiningar.
NMR litróf lausnar voru fengin við 310 K á 600 MHz Bruker Avance Neo litrófsmæli með QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR sýni sem innihalda 10 mg/mL einsleitt prótein merkt með 13C, 15N, leyst upp í 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Efnafræðilegar breytingar á NT2RepCT við pH 6,7 voru notaðar til að úthluta toppi 23 í 2D litrófinu 15N-HSQC.
Töfrahornssnúningur solid NMR (MAS) litróf 13C, 15N merkt vatnsgel voru skráð á Bruker Avance III HD litrófsmæli við 800 MHz búin 3,2 mm 13C/15N{1H} rafeindalausum rannsaka.Sýnishitastigi var stjórnað með því að nota gasstraum með breytilegu hitastigi við 277 K. Tvívíddar tvípóls snúningsómun (DARR)76 og útvarpstíðni endurtengingu (RFDR)77 litróf fengust við MAS tíðni 12,5 kHz og 20 kHz, í sömu röð.Krossskautun (CP) frá 1H til 13C var framkvæmd með því að nota línulegan ramp frá 60,0 til 48,0 kHz við 1H, 61,3/71,6 kHz við 13C (við 12,5/20 kHz MAS) og snertitíma 0,5–1 ms.Spinal6478 aftenging við 73,5 kHz var notuð við gagnasöfnun.Upptökutíminn var 10 millisekúndur og lotuseinkunin var 2,5 sekúndur.Eintengdu Cα/Cβ fylgnin sem sást í RFDR litrófinu var úthlutað á grundvelli einkennandi efnaskipta af leifum og margtengdum fylgni í DARR litrófinu.
Zipper79 gagnagrunnurinn (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) var notaður til að meta flöktahneigð og Rosetta orku fyrir NT, NTFlSp og NTMiSp.Rennilássgagnagrunnurinn reiknar Rosetta Energy80, sem sameinar nokkrar ókeypis orkuaðgerðir til að líkja og greina próteinbyggingu.Orkustig sem er -23 kcal/mól eða lægra gefur til kynna mikla tilhneigingu til tifs.Lægri orkan þýðir meiri stöðugleika β-þræðanna tveggja í rennilásnum.Að auki var Waltz algrímið notað til að spá fyrir um amyloidogenic svæði í NT, NTFlSp og NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT próteinlausninni var blandað saman við 2-(N-morfólínó)etansúlfónsýru (MES) jafnalausn við pH 5,5 og 6,0 til að lækka pH niður í pH 6 og 7, í sömu röð.Endanleg próteinstyrkur var 100 mg/ml.
Mælingar voru gerðar á J-1500 CD litrófsmæli (JASCO, USA) með 300 μL kúvettu með 0,1 cm ljósleið.Prótein voru þynnt í 10 μM (n = 1) í 20 mM fosfatbuffi (pH 8).Til að greina próteinstöðugleika í viðurvist salts voru prótein greind í sama styrk (n = 1) í 20 mM fosfatbuffi (pH 8) sem innihélt 154 mM NaF eða NaCl, í sömu röð.Hitaskannanir voru skráðir við 222 nm frá 25°C til 95°C með hitunarhraða 1°C/mín.Hlutfall innfæddra brotinna próteina var reiknað út með formúlunni (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Auk þess voru fimm litróf skráð fyrir hvert sýni frá 260 nm til 190 nm við 25°C og eftir hitun í 95°C.Fimm litróf voru tekin að meðaltali, sléttuð og breytt í mól sporöskjustig.Gögnin voru greind með Prisma 9.
Flúrljómunarstyrkur His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µL) var mældur í þríriti (n = 3) í 96 holu Corning plötum með svörtum gagnsæjum botni (Corning Glass 3881, USA) við kyrrstöður.Mælið sýni með flúrljómun sem byggir á plötulesara með örvunarbylgjulengd 395 nm og skráið losunina við 509 nm fyrir hlaup og 2 klukkustundum síðar við 37°C.Gögnin voru greind með Prisma 9.
Púrín núkleósíð fosfórýlasa virkni greiningarsett (flúorómetrísk aðferð, Sigma Aldrich) var notað samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.Til að mæla virkni í hlaupum og lausnum sem innihalda His-NT-PNP, blandaðu 10 ng af His-NT-PNP við 100 mg/ml NT í heildarrúmmálið 2 µL vegna þess að hlaupið gaf merki yfir greiningarbili settsins.Viðmið fyrir hlaup og lausnir án His-NT-PNP voru innifalin.Mælingarnar voru gerðar tvisvar (n = 2).Eftir að virknin var mæld var hvarfblandan fjarlægð og hlaupið myndað til að tryggja að hlaupið hélst ósnortið meðan á mælingunni stóð.Gögnin voru greind með Prisma 9.
Nánari upplýsingar um hönnun náms er að finna í Nature study abstract sem er tengt við þessa grein.
Myndir 1 og 2 sýna upphafsgögnin.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f og 6, aukamyndir.3, aukamynd.5a, d, aukamynd.6 og viðbótarmynd.8. Gögn Gögn úr þessari rannsókn eru hýst í Zenodo gagnagrunninum https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.NMR gögnin sem fengust í þessari rannsókn voru send á BMRBig geymsluna undir færslukenninu bmrbig36.Uppbygging GFP og PNP voru tekin úr PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. og Johansson, J. Spinning gervi kónguló silki.National Chemical.líffræði.11, 309–315 (2015).
Babb, PL o.fl.Erfðamengi Nephila clavipes undirstrikar fjölbreytileika kóngulóarsilkigenanna og flókna tjáningu þeirra.National Genette.49, 895–903 (2017).