Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Þú ert að nota vafraútgáfu með takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Að auki, til að tryggja áframhaldandi stuðning, sýnum við síðuna án stíla og JavaScript.
Rennistikur sem sýna þrjár greinar á hverri glæru.Notaðu til baka og næsta hnappa til að fara í gegnum glærurnar, eða rennibrautarhnappana í lokin til að fara í gegnum hverja glæru.

317 birgjar úr ryðfríu stáli spólu

Efnasamsetningartafla úr ryðfríu stáli efni

SPACA6 er yfirborðsprótein sem tjáir sæðisfrumur sem er mikilvægt fyrir samruna kynfruma við kynæxlun spendýra.Þrátt fyrir þetta grundvallarhlutverk er sértæk virkni SPACA6 illa skilin.Við útskýrum kristalbyggingu utanfrumu léns SPACA6 í upplausninni 2,2 Å, og afhjúpum tveggja léna prótein sem samanstendur af fjögurra þráða búnti og Ig-líkum β-samlokum sem eru tengdar með hálfsveigjanlegum hlekkjum.Þessi uppbygging líkist IZUMO1, öðru kynfrumusamruna-tengdu próteini, sem gerir SPACA6 og IZUMO1 að stofnendum yfirfjölskyldu frjóvgunartengdra próteina sem hér er vísað til sem IST yfirfjölskyldunnar.IST ofurfjölskyldan er byggingarlega skilgreind af snúnu fjögurra helix búnti sínu og pari af tvísúlfíðtengdum CXXC mótífum.Uppbygging byggð á AlphaFold leit á próteómi mannsins benti á fleiri próteinmeðlimi þessarar ofurfjölskyldu;sérstaklega, mörg þessara próteina taka þátt í kynfrumusamruna.SPACA6 uppbyggingin og tengsl þess við aðra meðlimi IST ofurfjölskyldunnar veita týnda hlekkinn í þekkingu okkar á samruna kynfrumu spendýra.
Hvert mannslíf byrjar á tveimur aðskildum haploid kynfrumum: sæði föðurins og eggi móðurinnar.Þessi sæðisfruma er sigurvegari mikils valferlis þar sem milljónir sæðisfrumna fara í gegnum kynfæri kvenna, yfirstíga ýmsar hindranir1 og gangast undir virkni, sem eykur hreyfanleika þeirra og ferli yfirborðshluta2,3,4.Jafnvel þótt sæði og eggfruma finni hvort annað er ferlinu ekki lokið enn.Eggfruman er umkringd lag af cumulus frumum og glýkóprótein hindrun sem kallast zona pellucida, sem sæði þarf að fara í gegnum til að komast inn í eggfruman.Sáðfrumur nota blöndu af yfirborðsviðloðunarsameindum og himnutengdum og seyttum ensímum til að yfirstíga þessar lokahindranir5.Þessar sameindir og ensím eru aðallega geymdar í innri himnunni og acrosomal fylki og greinast þegar ytri himna sæðisfrumunnar er rofin við acrosomal hvarf6.Lokaskrefið í þessu ákafa ferðalagi er sæðis-eggjabræðsluatburðurinn, þar sem frumurnar tvær sameina himnur sínar og verða að einni tvílita lífveru7.Þrátt fyrir að þetta ferli sé byltingarkennd í æxlun manna eru nauðsynlegar sameindasamskipti illa skilin.
Auk frjóvgunar kynfrumna hefur efnafræði samruna tveggja lípíða tvílaga verið mikið rannsökuð.Almennt séð er himnusamruni orkulega óhagstætt ferli sem krefst þess að próteinhvati gangist undir burðarbreytingu sem færir tvær himnur nær saman, brýtur samfellu þeirra og veldur samruna8,9.Þessir próteinhvatar eru þekktir sem fusogens og hafa fundist í ótal samrunakerfum.Þeir eru nauðsynlegir til að komast inn í hýsilfrumur (td gp160 í HIV-1, toppur í kransæðaveirum, hemagglutinin í inflúensuveirum)10,11,12 fylgju (syncytin)13,14,15 og kynfrumumyndandi samruna í neðri heilkjörnungum ( HAP2/GCS1 í plöntum, frumdýrum og liðdýrum) 16,17,18,19.Enn hefur ekki verið uppgötvað fósógen fyrir kynfrumur manna, þó að sýnt hafi verið fram á að nokkur prótein séu mikilvæg fyrir kynfrumutengingu og samruna.CD9 sem tjáð er með eggfrumu, þvert á himnuprótein sem þarf til samruna kynfrumna músa og manna, var það fyrsta sem uppgötvaðist 21,22,23.Þrátt fyrir að nákvæm virkni þess sé enn óljós, virðist hlutverk í viðloðun, uppbyggingu viðloðun fókus á egg microvilli, og / eða rétt staðsetning á yfirborði eggfrumu próteina líklega 24,25,26.Tvö dæmigerðustu próteinin sem eru mikilvæg fyrir kynfrumusamruna eru sæðispróteinið IZUMO127 og eggfrumupróteinið JUNO28, og gagnkvæm tengsl þeirra eru mikilvægt skref í kynfrumuþekkingu og viðloðun fyrir samruna.Karlkyns Izumo1 knockout mýs og Juno knockout mýs eru algjörlega dauðhreinsaðar, í þessum líkönum fara sæðisfrumur inn í perivitelline rúmið en kynfrumur sameinast ekki.Á sama hátt minnkaði samruni þegar kynfrumur voru meðhöndlaðar með and-IZUMO1 eða JUNO27,29 mótefnum í glasafrjóvgunartilraunum hjá mönnum.
Nýlega hefur nýlega uppgötvaður hópur sæðis-tjáðra próteina sem svipar til IZUMO1 og JUNO20,30,31,32,33,34,35.Sperm acrosomal membrane-associated protein 6 (SPACA6) hefur verið skilgreint sem nauðsynlegt fyrir frjóvgun í umfangsmikilli rannsókn á stökkbreytingu músa.Innsetning transgensins í Spaca6 genið framleiðir óbrjótanlegar sáðfrumur, þó þessar sáðfrumur síast inn í perivitelline rýmið 36 .Síðari útsláttarrannsóknir á músum staðfestu að Spaca6 er nauðsynlegt fyrir kynfrumusamruna 30,32.SPACA6 er nær eingöngu tjáð í eistum og hefur staðsetningarmynstur svipað því sem er í IZUMO1, þ.e. innan innri sæðisfrumna fyrir acrosomal viðbrögð, og flytur síðan til miðbaugssvæðis eftir acrosomal viðbrögð 30,32.Spaca6-samstæður eru til í ýmsum spendýrum og öðrum heilkjörnungum 30 og hefur verið sýnt fram á mikilvægi þess fyrir samruna kynfruma í mönnum með því að hindra frjóvgun í glasi með ónæmi fyrir SPACA6 30 .Ólíkt IZUMO1 og JUNO eru upplýsingar um uppbyggingu, samskipti og virkni SPACA6 enn óljós.
Til að skilja betur grundvallarferlið sem liggur að baki samruna sæðis og eggja úr mönnum, sem gerir okkur kleift að upplýsa framtíðarþróun í fjölskylduskipulagi og frjósemismeðferð, gerðum við SPACA6 byggingar- og lífefnafræðilegar rannsóknir.Kristalbygging utanfrumu léns SPACA6 sýnir fjögurra helical búnt (4HB) og immúnóglóbúlínlíkt (Ig-líkt) lén sem er tengt með hálfsveigjanlegum svæðum.Eins og spáð var í fyrri rannsóknum er 7,32,37 lénsuppbygging SPACA6 svipuð og í IZUMO1 úr mönnum og próteinin tvö deila óvenjulegu mótífi: 4HB með þríhyrningslaga helixyfirborði og pari af tvísúlfíðtengdum CXXC mótífum.Við leggjum til að IZUMO1 og SPACA6 skilgreini nú stærri, byggingarlega tengda ofurfjölskyldu próteina sem tengjast kynfrumusamruna.Með því að nota eiginleika sem eru einstakir fyrir ofurfjölskylduna, gerðum við tæmandi leit að AlphaFold byggingarprótein mannsins, auðkenndum fleiri meðlimi þessarar yfirfjölskyldu, þar á meðal nokkra meðlimi sem taka þátt í kynfrumusamruna og/eða frjóvgun.Nú virðist sem það sé sameiginlegt byggingarbrot og ofurfjölskylda próteina sem tengist kynfrumusamruna, og uppbygging okkar veitir sameindakort af þessum mikilvæga þætti kynfrumusamrunakerfis mannsins.
SPACA6 er einhliða gegnumhimnuprótein með einu N-tengdu glýkani og sex hugsanlegum tvísúlfíðtengjum (myndir S1a og S2).Við tjáðum utanfrumu lén manna SPACA6 (leifar 27-246) í Drosophila S2 frumum og hreinsuðum próteinið með því að nota nikkelsækni, katjónaskipti og stærðarútilokunarskiljun (mynd S1b).Hreinsað SPACA6 ectodomein er mjög stöðugt og einsleitt.Greining með stærðarútilokunarskiljun ásamt marghyrndri ljósdreifingu (SEC-MALS) leiddi í ljós einn topp með reiknaðan mólmassa 26,2 ± 0,5 kDa (mynd S1c).Þetta er í samræmi við stærð SPACA6 einliða ectodomeinsins, sem gefur til kynna að fáliðun hafi ekki átt sér stað við hreinsun.Auk þess sýndi hringlaga tvíhyggja (CD) litrófsgreining blandaða α/β uppbyggingu með bræðslumark 51,3 °C (mynd S1d,e).Afmótun CD litrófsins leiddi í ljós 38,6% α-helical og 15,8% β-stranded frumefni (Mynd S1d).
SPACA6 ectodomeinið var kristallað með því að nota tilviljunarkennd fylki sáningu38 sem leiddi til gagnasetts með upplausn 2,2 Å (tafla 1 og mynd S3).Með því að nota blöndu af gögnum um sameindaskipti sem byggir á bútum og SAD áfangaskiptingu með útsetningu fyrir brómíði til að ákvarða uppbyggingu (tafla 1 og mynd S4), samanstendur endanlegt hreinsað líkan af leifum 27–246.Á þeim tíma sem uppbyggingin var ákvörðuð voru engin tilrauna- eða AlphaFold mannvirki tiltæk.SPACA6 ectodomeinið mælist 20 Å × 20 Å × 85 Å, samanstendur af sjö þyrlum og níu β-þráðum og er með ílangan tertíer brot sem er stöðugt með sex tvísúlfíðtengi (mynd 1a, b).Veik rafeindaþéttleiki í lok Asn243 hliðarkeðjunnar gefur til kynna að þessi leifar sé N-tengd glýkósýlering.Uppbyggingin samanstendur af tveimur lénum: N-enda fjögurra helix búnti (4HB) og C-enda Ig-líkt léni með milliliðasvæði á milli þeirra (mynd 1c).
a Uppbygging utanfrumu léns SPACA6.Strip skýringarmynd af utanfrumu léni SPACA6, litur keðjunnar frá N til C-enda frá dökkbláum til dökkrauður.Sýstein sem taka þátt í tvísúlfíðtengjum eru auðkennd með magenta.b Gróðurfræði utanfrumusviðs SPACA6.Notaðu sama litasamsetningu og á mynd 1a.c SPACA6 utanfrumu lén.4HB, löm og Ig-lík lénsræmutöflurnar eru litaðar appelsínugult, grænt og blátt, í sömu röð.Lögin eru ekki teiknuð í mælikvarða.
4HB lénið í SPACA6 inniheldur fjórar helstu helices (helices 1–4), sem eru raðað í formi helical helix (mynd 2a), til skiptis á milli andhliðstæða og samhliða víxlverkunar (mynd 2b).Lítill auka einsnúningur (helix 1′) er lagður hornrétt á búntinn og myndar þríhyrning með þyrlunum 1 og 2. Þessi þríhyrningur er örlítið vansköpuð í þyrlusnúnu pakkningunni á tiltölulega þéttri pökkun þyrlna 3 og 4 ( mynd 2a).
4HB N-terminal strimlakort.b Efsta mynd af búnti af fjórum þyrlum, hver helix auðkenndur með dökkbláu á N-enda og dökkrauður á C-enda.c Skýringarmynd um spíralhjól að ofan og niður fyrir 4HB, þar sem hver leifar er sýnd sem hringur merktur eins bókstafs amínósýrukóða;aðeins fjórar amínósýrurnar efst á hjólinu eru númeraðar.Óskautaðar leifar eru litaðar gular, skautaðar óhlaðnar leifar eru litaðar grænar, jákvætt hlaðnar leifar eru litaðar bláar og neikvætt hlaðnar leifar eru litaðar rauðar.d Þríhyrndar hliðar á 4HB léninu, með 4HBs í appelsínugult og lamir í grænu.Bæði innskotin sýna stangalaga tvísúlfíðtengi.
4HB er einbeitt í innri vatnsfælin kjarna sem samanstendur aðallega af alifatískum og arómatískum leifum (mynd 2c).Kjarninn inniheldur tvísúlfíðtengi á milli Cys41 og Cys55 sem tengir þyrlur 1 og 2 saman í efri upphækkuðum þríhyrningi (mynd 2d).Tvö tvísúlfíðtengi til viðbótar mynduðust á milli CXXC mótífsins í Helix 1′ og annars CXXC mótífs sem fannst á oddinum á β-hárnálinni á lömsvæðinu (mynd 2d).Íhaldssöm arginínleif með óþekkt hlutverk (Arg37) er staðsett inni í holum þríhyrningi sem myndast af þyrlum 1′, 1 og 2. Alifatísk kolefnisatóm Cβ, Cγ og Cδ Arg37 hafa samskipti við vatnsfælna kjarnann og gúanidínhópar hans hreyfast í hringrás. milli þyrlna 1′ og 1 í gegnum víxlverkun milli Thr32 hryggjarins og hliðarkeðjunnar (mynd S5a, b).Tyr34 nær inn í holrúmið og skilur eftir tvö lítil holrúm þar sem Arg37 getur haft samskipti við leysirinn.
Ig-lík β-samloku lén eru stór yfirfjölskylda próteina sem deila sameiginlegum eiginleikum tveggja eða fleiri fjölþátta amphipathic β-blöð sem hafa samskipti í gegnum vatnsfælna kjarna 39. C-enda Ig-líka lénið af SPACA6 hefur sama mynstur og samanstendur af tveimur lögum (mynd S6a).Blað 1 er β-blað af fjórum þráðum (þræðir D, F, H og I) þar sem þræðir F, H og I mynda andhliða samsvörun og þræðir I og D taka á sig samhliða víxlverkun.Tafla 2 er lítið andhliða tvíþátta beta-blað (þræðir E og G).Innra tvísúlfíðtengi sást á milli C-enda E-keðjunnar og miðju H-keðjunnar (Cys170-Cys226) (Mynd S6b).Þetta tvísúlfíðtengi er hliðstætt tvísúlfíðtengi í β-samlokusvæði immúnóglóbúlíns40,41.
Fjögurra þráða β-blaðið snúist eftir allri lengd sinni og myndar ósamhverfar brúnir sem eru mismunandi að lögun og rafstöðueiginleikum.Þynnri brúnin er flatt vatnsfælinn umhverfisyfirborð sem sker sig úr miðað við ójöfn og rafstöðufræðilega fjölbreytt yfirborð í SPACA6 (mynd S6b,c).Geislabaugur af óvarnum karbónýl/amínóhópum og skautuðum hliðarkeðjum umlykur vatnsfælna yfirborðið (mynd S6c).Víðtækari jaðarinn er hulinn af lokuðum helical hluta sem lokar á N-endahluta vatnsfælna kjarnans og myndar þrjú vetnistengi með opnum skautahópi F-keðjunnar (Mynd S6d).C-endahluti þessarar brúnar myndar stóran vasa með vatnsfælnum kjarna að hluta til.Vasinn er umkringdur jákvæðum hleðslum vegna þriggja setta af tvöföldum arginínleifum (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 og Arg212-Arg214) og miðlægs histidíns (His220) (Mynd S6e).
Hjörsvæðið er stuttur hluti á milli spírusvæðisins og Ig-líka svæðisins, sem samanstendur af einu andhliðstæða þríþátta β-lagi (þræðir A, B og C), litlum 310 helix og nokkrum löngum tilviljunarkenndum helixhluta.(Mynd S7).Net samgildra og rafstöðueiginleika tengiliða á lömsvæðinu virðist koma á stöðugleika í stefnu milli 4HB og Ig-líka lénsins.Hægt er að skipta netinu í þrjá hluta.Fyrri hlutinn inniheldur tvö CXXC mótíf (27CXXC30 og 139CXXC142) sem mynda par af tvísúlfíðtengjum á milli β-hárnálsins í löminni og 1′ helix í 4HB.Seinni hlutinn inniheldur rafstöðueiginleikar milli Ig-líka lénsins og lömarinnar.Glu132 í löminni myndar saltbrú með Arg233 í Ig-líka léninu og Arg135 í löminni.Þriðji hlutinn inniheldur samgilt tengi milli Ig-líka lénsins og lömsvæðisins.Tvö tvísúlfíðtengi (Cys124-Cys147 og Cys128-Cys153) tengja lömlykkjuna við tengil sem er stöðugt með rafstöðueiginleikum milli Gln131 og burðarásar virka hópsins, sem gefur aðgang að fyrsta Ig-líka léninu.keðja.
Uppbygging SPACA6 ectodomeinsins og einstök uppbygging 4HB og Ig-líkra léna voru notuð til að leita að byggingarfræðilega svipuðum skrám í próteingagnagrunnum 42 .Við greindum samsvörun með háum Dali Z stigum, litlum staðalfrávikum og stórum LALI stigum (síðarnefnda er fjöldi byggingarfræðilega jafngildra leifa).Þó að fyrstu 10 slögin úr leitinni í heild sinni (Tafla S1) hafi ásættanlegt Z-stig >842, sýndi leit að 4HB eða Ig-líku léni eingöngu að flest þessara snertinga samsvaruðu eingöngu β-samlokum.alls staðar nálægur fellingur sem finnst í mörgum próteinum.Allar þrjár leitirnar í Dali skiluðu aðeins einni niðurstöðu: IZUMO1.
Það hefur lengi verið gefið til kynna að SPACA6 og IZUMO1 deili skipulagslega líkt7,32,37.Þrátt fyrir að ecto-lén þessara tveggja kynfrumusamruna-tengdu próteina deili aðeins 21% raðauðkenni (Mynd S8a), leyfðu flóknar vísbendingar, þar á meðal varðveitt tvísúlfíðtengimynstur og spáð C-enda Ig-líkt lén í SPACA6, snemma tilraunir til að byggja upp homology líkan af A a SPACA6 mús sem notar IZUMO1 sem sniðmát37.Uppbygging okkar staðfestir þessar spár og sýnir raunverulegt líkt.Reyndar deila SPACA6 og IZUMO137,43,44 mannvirkin sömu tveggja léns arkitektúr (Mynd S8b) með svipuðum 4HB og Ig-eins og β-samloku lénum tengd með löm svæði (Mynd S8c).
IZUMO1 og SPACA6 4HB hafa sameiginlegan mun frá hefðbundnum spíralbúntum.Dæmigert 4HB, eins og þau sem finnast í SNARE próteinfléttum sem taka þátt í samruna innkirtla 45,46, hafa jafnt dreift þyrlur sem viðhalda stöðugri sveigju um miðás 47. Aftur á móti voru þyrlusvæðin í bæði IZUMO1 og SPACA6 brengluð, með breytilegri sveigju og ójöfn pökkun (Mynd S8d).Snúningurinn, líklega af völdum þríhyrningsins sem myndaður er af þyrlum 1′, 1 og 2, er haldið í IZUMO1 og SPACA6 og stöðugur með sama CXXC mótífi á helix 1′.Hins vegar, viðbótar tvísúlfíðtengi sem finnast í SPACA6 (Cys41 og Cys55 sem tengja samgilt þyrlur 1 og 2 hér að ofan) skapar skarpari topp á þríhyrningapunktinum, sem gerir SPACA6 snúnari en IZUMO1, með meira áberandi þríhyrninga í holrúmi.Að auki skortir IZUMO1 Arg37 sem sést í miðju þessa hola í SPACA6.Aftur á móti hefur IZUMO1 dæmigerðri vatnsfælin kjarna af alifatískum og arómatískum leifum.
IZUMO1 hefur Ig-líkt lén sem samanstendur af tvíþátta og fimmþátta β-blaði43.Auka strengurinn í IZUMO1 kemur í stað spólunnar í SPACA6, sem hefur samskipti við F strenginn til að takmarka hryggjartengi í strengnum.Áhugaverður samanburðarpunktur er spáð yfirborðshleðsla Ig-líkra léna próteinanna tveggja.IZUMO1 yfirborðið er meira neikvætt hlaðið en SPACA6 yfirborðið.Aukahleðsla er staðsett nálægt C-endanum sem snýr að sæðishimnunni.Í SPACA6 voru sömu svæði hlutlausari eða jákvætt hlaðin (mynd S8e).Til dæmis eru vatnsfælin yfirborð (þynnri brúnir) og jákvætt hlaðnar gryfjur (breiðari brúnir) í SPACA6 neikvætt hlaðnar í IZUMO1.
Þrátt fyrir að tengslin og efri uppbyggingarþættir milli IZUMO1 og SPACA6 séu vel varðveittir, sýndi burðarvirkja röðun Ig-eins léna að lénin tvö eru mismunandi í almennri stefnumörkun þeirra miðað við hvert annað (mynd S9).Spíralbúnt IZUMO1 er bogið um β-samlokuna, sem skapar áður lýst „boomerang“ lögun í um 50° frá miðásnum.Aftur á móti hallaði þyrillaga geislinn í SPACA6 um 10° í gagnstæða átt.Munurinn á þessum stefnum stafar líklega af mismun á lamir svæðinu.Á frumröðinni deila IZUMO1 og SPACA6 litlu röð líkt við löm, að undanskildum cysteini, glýsíni og asparaginsýruleifum.Þar af leiðandi eru vetnistengi og rafstöðueiginleikar allt öðruvísi.IZUMO1 og SPACA6 deila β-blaðs aukabyggingarþætti, þó að keðjurnar í IZUMO1 séu mun lengri og 310 helix (helix 5) er einstakt fyrir SPACA6.Þessi munur leiðir til mismunandi lénsstefnu fyrir tvö annars svipuð prótein.
Dali netþjónaleitin okkar leiddi í ljós að SPACA6 og IZUMO1 eru einu tvær tilraunaákveðnu mannvirkin sem eru geymd í próteingagnagrunninum sem hafa þessa tilteknu 4HB falt (tafla S1).Nýlega hefur DeepMind (Alphabet/Google) þróað AlphaFold, kerfi sem byggir á taugakerfi sem getur sagt nákvæmlega fyrir um þrívíddarbyggingu próteina úr frumröðum48.Stuttu eftir að við leystum SPACA6 uppbygginguna var AlphaFold gagnagrunnurinn gefinn út, sem útvegaði forspárbyggingarlíkön sem ná yfir 98,5% allra próteina í próteómi mannsins48,49.Með því að nota upplýsta SPACA6 uppbyggingu okkar sem leitarlíkan, burðarvirkjasamheitaleit að líkaninu í AlphaFold mannlega próteóminu benti á frambjóðendur með mögulega byggingarlíkindi við SPACA6 og IZUMO1.Miðað við ótrúlega nákvæmni AlphaFold við að spá fyrir um SPACA6 (Mynd S10a) - sérstaklega 1,1 Árms ectodomeinið samanborið við upplýsta uppbyggingu okkar (Mynd S10b) - getum við verið viss um að auðkenndar SPACA6 samsvörun eru líkleg til að vera nákvæmar.
Áður leitaði PSI-BLAST að IZUMO1 þyrpingunni með þremur öðrum sæðistengdum próteinum: IZUMO2, IZUMO3 og IZUMO450.AlphaFold spáði því að þessi IZUMO fjölskylduprótein brotnuðust inn í 4HB lénið með sama tvísúlfíðtengimynstri og IZUMO1 (myndir 3a og S11), þó að þau skorti Ig-líkt lén.Það er tilgáta að IZUMO2 og IZUMO3 séu einhliða himnuprótein sem líkjast IZUMO1, en IZUMO4 virðist vera seytt.Virkni IZUMO 2, 3 og 4 próteina í kynfrumusamruna hefur ekki verið ákvörðuð.Vitað er að IZUMO3 gegnir hlutverki í lífmyndun acrosome við þróun sæðisfruma51 og IZUMO prótein myndar flókið50.Varðveisla IZUMO próteina í spendýrum, skriðdýrum og froskdýrum bendir til þess að hugsanleg virkni þeirra sé í samræmi við önnur þekkt kynfrumusamruna-tengd prótein, svo sem DCST1/2, SOF1 og FIMP.
Skýringarmynd af lénsarkitektúr IST yfirfjölskyldunnar, með 4HB, löm og Ig-lík lén auðkennd í appelsínugulu, grænu og bláu, í sömu röð.IZUMO4 hefur einstakt C-enda svæði sem lítur svart út.Staðfest og hugsanleg tvísúlfíðtengi eru sýnd með heilum línum og punktalínum, í sömu röð.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F15), (AlphaFold TM 95), (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) eru sýndar í sama litasviði og spjaldið A. Dísúlfíðtengi eru sýnd með magenta.TMEM95, IZUMO2 og IZUMO3 himnuþyrlur eru ekki sýndar.
Ólíkt IZUMO próteininu er talið að önnur SPACA prótein (þ.e. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 og SPACA9) séu byggingarlega ólík SPACA6 (mynd S12).Aðeins SPACA9 hefur 4HB, en ekki er búist við að hann hafi sömu hliðstæðu-and-samsíða stefnu eða sömu tvísúlfíðtengi og SPACA6.Aðeins SPACA1 hefur svipað Ig-líkt lén.AlphaFold spáir því að SPACA3, SPACA4 og SPACA5 hafi allt aðra uppbyggingu en SPACA6.Athyglisvert er að SPACA4 er einnig þekkt fyrir að gegna hlutverki í frjóvgun, en í meira mæli en SPACA6, og auðveldar þess í stað samspil sæðisfruma og eggfrumu zona pellucida52.
AlphaFold leit okkar fann aðra samsvörun fyrir IZUMO1 og SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, stakt sæðissértækt transhimnuprótein, gerir karlkyns músum ófrjóar þegar þær eru fjarlægðar 32,33.Sáðfrumur sem skorti TMEM95 höfðu eðlilega formgerð, hreyfigetu og getu til að komast í gegnum zona pellucida og bindast egghimnu, en gátu ekki sameinast eggfrumuhimnu.Fyrri rannsóknir hafa sýnt að TMEM95 deilir byggingarlíkindum með IZUMO133.Reyndar staðfesti AlphaFold líkanið að TMEM95 er 4HB með sama pari af CXXC mótífum og IZUMO1 og SPACA6 og sama viðbótar tvísúlfíðtengi milli þyrlna 1 og 2 sem finnast í SPACA6 (mynd 3a og S11).Þrátt fyrir að TMEM95 skorti Ig-líkt lén, hefur það svæði með tvísúlfíðtengimynstri svipað og SPACA6 og IZUMO1 lömsvæðin (mynd 3b).Þegar þetta handrit var gefið út tilkynnti forprentþjónninn um uppbyggingu TMEM95, sem staðfestir niðurstöðu AlphaFold53.TMEM95 er mjög svipað SPACA6 og IZUMO1 og er þróunarlega varðveitt þegar í froskdýrum (mynd 4 og S13).
PSI-BLAST leitin notaði NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP og SOF1 gagnagrunna til að ákvarða staðsetningu þessara raða í lífsins tré.Fjarlægðir milli greinarpunkta eru ekki sýndar í mælikvarða.
Sláandi heildarbyggingarlíkingin á milli SPACA6 og IZUMO1 bendir til þess að þeir séu stofnmeðlimir í varðveittri byggingar yfirfjölskyldu sem inniheldur TMEM95 og IZUMO 2, 3 og 4 prótein.þekktir meðlimir: IZUMO1, SPACA6 og TMEM95.Vegna þess að aðeins fáir meðlimir eru með Ig-lík lén, er aðalsmerki IST ofurfjölskyldunnar 4HB lénið, sem hefur einstaka eiginleika sem eru sameiginlegir öllum þessum próteinum: 1) Spólað 4HB með þyrlum raðað í andhliða/samsíða víxl (mynd 5a), 2) búnturinn er með þríhyrningslaga flöt sem samanstendur af tveimur þyrlum innan búntsins og þriðju lóðrétta helix (Mynd lyklasvæði (Mynd 5c). Vitað er að CXXC mótífið, sem finnst í þíóredoxínlíkum próteinum, virkar sem redoxskynjari 54,55,56, en mótífið í IST fjölskyldumeðlimum getur tengst prótein tvísúlfíð ísómerasum eins og ERp57 í kynfrumusamruna.Hlutverk eru tengd 57,58.
Meðlimir IST ofurfjölskyldunnar eru skilgreindir af þremur einkennandi eiginleikum 4HB lénsins: fjórar þyrlur sem skiptast á samhliða og andhliðstæða stefnu, ba-þríhyrningslaga þyrillaga knippi og ca CXXC tvöfalt mótíf sem myndast á milli lítilla sameinda.) N-enda helixar (appelsínugular) og lamir svæði β-hárnál (grænt).
Í ljósi þess að SPACA6 og IZUMO1 eru lík, var hæfni þess fyrrnefnda til að bindast IZUMO1 eða JUNO prófuð.Biolayer interferometry (BLI) er hreyfifræðileg bindiaðferð sem hefur áður verið notuð til að mæla víxlverkun milli IZUMO1 og JUNO.Eftir ræktun á bíótínmerkta skynjaranum með IZUMO1 sem beitu með háum styrk af JUNO greiniefni, greindist sterkt merki (mynd S14a), sem gefur til kynna bindingu framkallaða breytingu á þykkt lífefnisins sem er fest við skynjaraoddinn.Svipuð merki (þ.e. JUNO tengt við skynjarann ​​sem beita gegn IZUMO1 greiniefni) (Mynd S14b).Ekkert merki greindist þegar SPACA6 var notað sem greiniefni gegn skynjarabundnu IZUMO1 eða skynjarabundnu JUNO (Mynd S14a,b).Skortur á þessu merki gefur til kynna að utanfrumu lén SPACA6 hefur ekki samskipti við utanfrumu lén IZUMO1 eða JUNO.
Vegna þess að BLI prófunin byggir á líftínýleringu óbundinna lýsínleifa á beitupróteininu, getur þessi breyting komið í veg fyrir bindingu ef lýsínleifar taka þátt í víxlverkuninni.Að auki getur stefna bindingarinnar miðað við skynjarann ​​skapað sterískar hindranir, þannig að hefðbundnar niðurfellingarprófanir voru einnig gerðar á raðbrigða SPACA6, IZUMO1 og JUNO ectodomeinunum.Þrátt fyrir þetta felldi SPACA6 ekki út með His-merktu IZUMO1 eða His-merktu JUNO (mynd S14c, d), sem gefur til kynna engin milliverkun í samræmi við það sem sést í BLI tilraunum.Sem jákvæð viðmiðun staðfestum við víxlverkun JUNO með merktum His IZUMO1 (myndir S14e og S15).
Þrátt fyrir byggingu líkt á milli SPACA6 og IZUMO1 kemur vanhæfni SPACA6 til að bindast JUNO ekki á óvart.Yfirborð manna IZUMO1 hefur meira en 20 leifar sem hafa samskipti við JUNO, þar á meðal leifar frá hverju af þremur svæðunum (þó flestar þeirra séu staðsettar á lamir svæðinu) (Mynd S14f).Af þessum leifum er aðeins ein varðveitt í SPACA6 (Glu70).Þó að margar leifaskiptingar héldu upprunalegum lífefnafræðilegum eiginleikum sínum, var nauðsynlegu Arg160 leifin í IZUMO1 skipt út fyrir neikvætt hlaðna Asp148 í SPACA6;fyrri rannsóknir hafa sýnt að Arg160Glu stökkbreytingin í IZUMO1 eyðir nánast algjörlega bindingu við JUNO43.Að auki jók munurinn á lénsstefnu milli IZUMO1 og SPACA6 verulega yfirborðsflatarmál JUNO-bindingarstaðarins á samsvarandi svæði á SPACA6 (mynd S14g).
Þrátt fyrir þekkta þörf fyrir SPACA6 fyrir kynfrumusamruna og líkingu þess við IZUMO1, virðist SPACA6 ekki hafa jafngilda JUNO bindivirkni.Þess vegna höfum við leitast við að sameina byggingargögn okkar og vísbendingar um mikilvægi sem þróunarlíffræði gefur.Röð röðun SPACA6 samhljóða sýnir varðveislu á sameiginlegri uppbyggingu utan spendýra.Til dæmis eru cysteinleifar til staðar jafnvel í fjarskyldum froskdýrum (mynd 6a).Með því að nota ConSurf netþjóninn voru gögn um varðveislu á mörgum röð röðun af 66 röðum kortlögð á SPACA6 yfirborðið.Þessi tegund greininga getur sýnt hvaða leifar hafa varðveist við próteinþróun og getur gefið til kynna hvaða yfirborðssvæði gegna hlutverki í virkni.
a Röð röðun á SPACA6 ectodomeinum frá 12 mismunandi tegundum sem eru unnin með CLUSTAL OMEGA.Samkvæmt ConSurf greiningu eru íhaldssamustu stöðurnar merktar með bláu.Cysteinleifar eru auðkenndar með rauðu.Lénsmörk og aukabyggingarþættir eru sýndir efst á röðuninni, þar sem örvar gefa til kynna β-þræði og bylgjur gefa til kynna þyrlur.NCBI aðgangsauðkennin sem innihalda raðirnar eru: manneskja (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin api (Cebus mimic, XP_017359366), hestur (Equus caballus, XP_10235 killer, XP_102ca, XP_10235 killer0 eða XP_0023) 032_034).), sauðfé (Ovis aries, XP_014955560), fíll (Loxodonta africana, XP_010585293), hundur (Canis lupus familyis, XP_025277208), mús (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil (XP381, XP311, XP31, XP311, XP311, XP311, XP31, XP311 ), Platypus, 8) , 61_89 og Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Tölunin er byggð á mannlegri röð.b Yfirborðsframsetning á SPACA6 uppbyggingunni með 4HB efst og Ig-líkt lén neðst, litir byggðir á mati á varðveislu frá ConSurf þjóninum.Bestu varðveittu hlutarnir eru í bláu, miðlungs varðveittu hlutarnir eru í hvítu og þeir sem minnst varðveittu eru í gulu.fjólublátt cystein.Þrír yfirborðsblettir sem sýna mikla vernd eru sýndir í innfelldu merktum plástunum 1, 2 og 3. 4HB teiknimynd er sýnd í innfellingunni efst til hægri (sama litasamsetning).
SPACA6 uppbyggingin hefur þrjú mjög varðveitt yfirborðssvæði (mynd 6b).Plástur 1 spannar 4HB og lömsvæðið og inniheldur tvær varðveittar CXXC tvísúlfíðbrýr, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 lömnet (Mynd S7), og þrjár varðveittar ytri arómatískar leifar (Phe31, Tyr73, Phe137)).breiðari brún Ig-líka lénsins (mynd S6e), sem táknar nokkrar jákvætt hlaðnar leifar á sæðisyfirborðinu.Athyglisvert er að þessi plástur inniheldur mótefnamyndefni sem áður hefur verið sýnt fram á að trufla SPACA6 30 virkni.Svæði 3 spannar lömina og aðra hlið Ig-líka lénsins;þetta svæði inniheldur varðveitt prólín (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) og skautaðar/hlaðnar leifar sem snúa út á við.Það kemur á óvart að flestar leifarnar á yfirborði 4HB eru mjög breytilegar (mynd 6b), þó að fellingin sé varðveitt í gegnum SPACA6 samstæðuna (eins og gefið er til kynna með íhaldssemi vatnsfælna búntskjarna) og utan IST ofurfjölskyldunnar.
Þrátt fyrir að þetta sé minnsta svæðið í SPACA6 með fæstum greinanlegum aukabyggingarþáttum, þá eru margar lamarsvæðisleifar (þar á meðal svæði 3) mjög varðveittar meðal SPACA6 samhljóða, sem gæti bent til þess að stefnumörkun spírulaga búntsins og β-samlokunnar gegni hlutverki.sem íhaldsmaður.Hins vegar, þrátt fyrir víðtæka vetnistengingu og rafstöðueiginleika á lamir svæðinu SPACA6 og IZUMO1, má sjá vísbendingar um innri sveigjanleika í röðun hinna mörgu leyfilegu mannvirkja IZUMO137,43,44.Jöfnun einstakra léna skarast vel, en stefnumörkun lénanna miðað við hvert annað var mismunandi frá 50° til 70° frá miðásnum (mynd S16).Til að skilja sköpulagsvirkni SPACA6 í lausn voru SAXS tilraunir gerðar (mynd S17a, b).Ab initio endurbygging SPACA6 ectodomin samræmdist stangir kristal uppbyggingu (Mynd S18), þó að Kratky söguþræði sýndi nokkurn veginn sveigjanleika (Mynd S17b).Þessi sköpulag er andstætt IZUMO1, þar sem óbundið prótein tekur á sig búmerang lögun bæði í grindunum og í lausn43.
Til að bera kennsl á sveigjanlega svæðið sérstaklega var vetnis-deuterium skipta massagreiningu (H-DXMS) framkvæmd á SPACA6 og borin saman við gögn sem áður voru fengin um IZUMO143 (Mynd 7a,b).SPACA6 er greinilega sveigjanlegri en IZUMO1, eins og gefur til kynna með hærra deuteriumskiptum í gegnum bygginguna eftir 100.000 s skipti.Í báðum mannvirkjum sýnir C-endahluti lömsvæðisins mikið skipti, sem líklega leyfir takmarkaðan snúning 4HB og Ig-líkra léna miðað við hvert annað.Athyglisvert er að C-endahluti SPACA6 lömarinnar, sem samanstendur af 147CDLPLDCP154 leifinni, er mjög varðveitt svæði 3 (mynd 6b), sem hugsanlega gefur til kynna að sveigjanleiki milli léna sé þróunarlega varðveittur eiginleiki SPACA6.Samkvæmt sveigjanleikagreiningunni sýndu CD varmabræðslugögn að SPACA6 (Tm = 51,2°C) er minna stöðugt en IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Mynd S1e og S19).
a H-DXMS myndir af SPACA6 og b IZUMO1.Hlutfall deuterium skipti var ákvarðað á tilgreindum tímapunktum.Stig vetnis-deuteriumskipta er gefið til kynna með lit á hallakvarða frá bláu (10%) til rautt (90%).Svartir kassar tákna svæði með miklum skiptum.Mörk 4HB, löm og Ig-lík léns sem sjást í kristalbyggingunni eru sýnd fyrir ofan frumröðina.Deuteriumskiptistig við 10 s, 1000 s og 100.000 s voru teiknuð á ræmurit sem var lagt ofan á gagnsæ sameindaflöt SPACA6 og IZUMO1.Hlutar mannvirkja með deuteriumskiptagildi undir 50% eru litaðir hvítir.Svæði yfir 50% H-DXMS skipti eru lituð í hallakvarða.
Notkun CRISPR/Cas9 og músargena útsláttar erfðafræðilegra aðferða hefur leitt til auðkenningar á nokkrum þáttum sem eru mikilvægir fyrir sæðis- og eggbindingu og samruna.Burtséð frá vel einkennandi samspili IZUMO1-JUNO og CD9 uppbyggingu, eru flest prótein sem tengjast kynfrumusamruna enn óljós í uppbyggingu og virkni.Lífeðlisfræðileg og byggingareinkenni SPACA6 er annar hluti af viðloðun/samruna sameindaþrautinni við frjóvgun.
SPACA6 og aðrir meðlimir IST ofurfjölskyldunnar virðast vera mjög varðveittir í spendýrum sem og einstökum fuglum, skriðdýrum og froskdýrum;í raun er talið að SPACA6 sé jafnvel nauðsynlegt fyrir frjóvgun í sebrafiskum 59. Þessi dreifing er svipuð öðrum þekktum kynfrumusamruna-tengdum próteinum eins og DCST134, DCST234, FIMP31 og SOF132, sem bendir til þess að þessir þættir séu HAP2-skortur (einnig þekkt sem GCS1) prótein sem eru ábyrg fyrir hvatavirkni margra protista., plöntur og liðdýr.Frjóvguð samrunaprótein 60, 61. Þrátt fyrir mikla byggingarlíkingu á milli SPACA6 og IZUMO1 leiddi útslagning gena sem kóða annað hvort þessara próteina til ófrjósemi í karlkyns músum, sem gefur til kynna að virkni þeirra í kynfrumusamruna sé ekki tvítekinn..Í stórum dráttum er ekkert af þekktum sæðispróteinum sem þarf fyrir viðloðun fasa samruna óþarfi.
Það er enn opin spurning hvort SPACA6 (og aðrir meðlimir IST ofurfjölskyldunnar) taki þátt í samskiptamótum, myndi innan kynfrumnanet til að ráða mikilvæg prótein til samrunapunkta, eða jafnvel virka sem fimmtileg fusogens.Samhliða ónæmisútfellingarrannsóknir í HEK293T frumum leiddu í ljós víxlverkun milli IZUMO1 í fullri lengd og SPACA632.Hins vegar höfðu raðbrigða ectodomeinin okkar ekki samskipti in vitro, sem bendir til þess að milliverkanirnar sem sjást í Noda o.fl.var báðum eytt í smíðinni (ath. umfrymishala IZUMO1, sem hefur verið sýnt fram á að sé óþarfi fyrir frjóvgun62).Að öðrum kosti geta IZUMO1 og/eða SPACA6 krafist sérstakrar bindingarumhverfis sem við endurskapum ekki in vitro, svo sem lífeðlisfræðilega sértæka sköpulag eða sameindafléttur sem innihalda önnur prótein (þekkt eða ekki enn uppgötvað).Þrátt fyrir að talið sé að IZUMO1 ectodomin miðli viðtengingu sæðisfruma við eggið í perivitelline rýminu, er tilgangur SPACA6 ectodomeinsins óljós.
Uppbygging SPACA6 sýnir nokkur varðveitt yfirborð sem geta tekið þátt í prótein-próteinvíxlverkunum.Hinn varðveitti hluti lömsvæðisins sem er beint við hliðina á CXXC mótífinu (tilnefndur Patch 1 hér að ofan) hefur nokkrar arómatískar leifar sem snúa út á við sem eru oft tengdar vatnsfælnum og π-stafla samskiptum milli lífsameinda.Breiðu hliðar Ig-líka lénsins (svæði 2) mynda jákvætt hlaðna gróp með mjög varðveittum Arg og His leifum og mótefni gegn þessu svæði hafa áður verið notuð til að hindra kynfrumusamruna 30 .Mótefnið þekkir línulegu epitopuna 212RIRPAQLTHRGTFS225, sem hefur þrjár af sex arginínleifum og mjög varðveitt His220.Ekki er ljóst hvort truflunin er vegna stíflu á þessum tilteknu leifum eða öllu svæðinu.Staðsetning þessa bils nálægt C-enda β-samlokunnar gefur til kynna cis-víxlverkun við nálæg sæðisprótein, en ekki við eggfrumuprótein.Ennfremur getur varðveisla á mjög sveigjanlegum prólínríkum flækjum (staður 3) innan lömarinnar verið staðurinn fyrir prótein-prótein víxlverkun eða, líklegra, gefið til kynna að sveigjanleiki haldist á milli sviðanna tveggja.Kyn er mikilvægt fyrir hið óþekkta hlutverk SPACA6.samruna kynfrumna.
SPACA6 hefur eiginleika millifrumuviðloðunarpróteina, þar á meðal Ig-líkar β-samlokur.Mörg límprótein (td kadherín, integrín, adhesín og IZUMO1) hafa eitt eða fleiri β-samlokusvæði sem teygja prótein frá frumuhimnunni til umhverfismarkmiða þeirra63,64,65.Ig-líka lénið í SPACA6 inniheldur einnig mótíf sem er almennt að finna í β-samlokum viðloðun og samloðun: tvöfalda samsíða þræði á endum β-samloka, þekkt sem vélrænar klemmur66.Talið er að þetta mótíf auki viðnám gegn klippikrafti, sem er dýrmætt fyrir prótein sem taka þátt í millifrumusamskiptum.Hins vegar, þrátt fyrir þessa líkingu við adhesín, eru engar vísbendingar um að SPACA6 hafi samskipti við eggjahvítu.SPACA6 ectodomin getur ekki tengst JUNO og SPACA6-tjáandi HEK293T frumur, eins og sýnt er hér, hafa varla samskipti við eggfrumur sem vantar zona 32 .Ef SPACA6 kemur á milli kynfrumnatengsla geta þessar milliverkanir þurft breytingar eftir þýðingu eða stöðugleika með öðrum sæðispróteinum.Til stuðnings síðari tilgátunni bindast sáðfrumur sem skortir IZUMO1 við eggfrumur, sem sýnir að aðrar sameindir en IZUMO1 taka þátt í kynfrumuviðloðun skrefi 27.
Mörg veiru-, frumu- og þróunarsamrunaprótein hafa eiginleika sem spá fyrir um virkni þeirra sem fusogens.Til dæmis hafa veirusamrunaglýkóprótein (flokkar I, II og III) vatnsfælin samrunapeptíð eða lykkju í enda próteinsins sem er sett inn í hýsilhimnuna.Vatnssæknikort IZUMO143 og uppbygging (ákvörðuð og spáð) IST yfirfjölskyldunnar sýndu ekkert sjáanlegt vatnsfælin samrunapeptíð.Þannig að ef einhver prótein í IST ofurfjölskyldunni virka sem fusogens, þá gera þau það á annan hátt en önnur þekkt dæmi.
Að lokum er virkni meðlima IST ofurfjölskyldu próteina sem tengjast kynfrumusamruna enn spennandi ráðgáta.Einkennandi SPACA6 raðbrigða sameindin okkar og leyst uppbygging hennar mun veita innsýn í tengsl þessara sameiginlegu mannvirkja og hlutverk þeirra í kynfrumutengingu og samruna.
DNA röðin sem samsvarar spáð SPACA6 ectodomi úr mönnum (NCBI aðgangsnúmer NP_001303901.1; leifar 27–246) var kódon-bjartsýni fyrir tjáningu í Drosophila melanogaster S2 frumum og mynduð sem genabrot með röðinni sem kóðar Kozak (Eurofins Genomics)., BiP seytingarmerkið og samsvarandi 5′ og 3′ enda fyrir bindingaróháða klónun þessa gena í pMT tjáningarferju sem byggir á metallothionein promotera breyttum fyrir val með púrómýsíni (pMT-puro).pMT-puro vektorinn kóðar klofningsstað fyrir trombín sem fylgt er eftir með 10x-His C-enda merki (Mynd S2).
Stöðug flutningur á SPACA6 pMT-puro ferjunni í D. melanogaster S2 (Gibco) frumur var framkvæmd á svipaðan hátt og aðferðin sem notuð var fyrir IZUMO1 og JUNO43.S2 frumur voru þíðaðar og ræktaðar í Schneider's medium (Gibco) sem bætt var við lokastyrk 10% (v/v) hitaóvirkjuð fósturkálfsermi (Gibco) og 1X sveppalyfjasýklalyf (Gibco).Snemma yfirferðarfrumur (3,0 x 106 frumur) voru húðaðar í einstökum holum af 6-brunnu plötum (Corning).Eftir 24 klst ræktun við 27°C voru frumur transsmitaðar með blöndu af 2 mg af SPACA6 pMT-puro ferjunni og Effectene transfection hvarfefni (Qiagen) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda.Smitaðar frumur voru ræktaðar í 72 klukkustundir og síðan safnað með 6 mg/ml púrómýsíni.Frumur voru síðan einangraðar úr heill Schneider's miðli og settar í sermisfrían Insect-XPRESS miðil (Lonza) til að framleiða prótein í stórum stíl.1 L lota af S2 frumurækt var ræktuð í 8–10 × 106 ml-1 frumur í 2 L loftræstri flatbotna pólýprópýlen Erlenmeyer flösku og síðan sótthreinsuð með lokastyrk 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) og dauðhreinsuð.framkallað.Framkölluðu ræktirnar voru ræktaðar við 27°C við 120 snúninga á mínútu í fjóra daga.
Skilyrt miðill sem innihélt SPACA6 var einangraður með skilvindu við 5660×g við 4°C og fylgt eftir með Centramate snertiflæðissíunarkerfi (Pall Corp) með 10 kDa MWCO himnu.Berið óblandaðan miðil sem inniheldur SPACA6 á 2 ml Ni-NTA agarósa resin (Qiagen) súlu.Ni-NTA plastefnið var þvegið með 10 súlurúmmáli (CV) af jafnalausn A og síðan var 1 CV af jafnalausn A bætt við til að gefa endanlega ímidazólstyrk upp á 50 mM.SPACA6 var skolað út með 10 ml af jafnalausn A bætt við imídasóli að lokastyrk upp á 500 mM.Þrömbíni í takmörkunarflokki (Millipore Sigma) var bætt beint í skilunarslönguna (MWCO 12-14 kDa) við 1 einingu á mg SPACA6 á móti 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 og 150 mM NaCl (buffi B) fyrir skilun.) við 4°C í 48 klst.Þrombín-klofnað SPACA6 var síðan þynnt þrisvar sinnum til að draga úr saltstyrk og hlaðið á 1 ml MonoS 5/50 GL katjónaskiptasúlu (Cytiva/GE) í jafnvægi með 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Katjónaskiptarinn var þveginn með 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, síðan var SPACA6 skolað með línulegum halla frá 0 til 500 mm NaCl í 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 fyrir 25 OK.Eftir jónaskiptaskiljun var SPACA6 þétt í 1 ml og skolað í sundur úr ENrich SEC650 10 x 300 súlu (BioRad) sem var jafnað með jafnalausn B. Samkvæmt litskiljuninni, sameinuðust og þykkni brot sem innihalda SPACA6.Hreinleika var stjórnað með Coomassie-lituðu rafdrætti á 16% SDS-pólýakrýlamíð hlaupi.Próteinstyrkur var magngreindur með gleypni við 280 nm með því að nota Beer-Lambert lögmálið og fræðilegan mólútrýmingarstuðul.
Hreinsað SPACA6 var skilað yfir nótt gegn 10 mM natríumfosfati, pH 7,4 og 150 mM NaF og þynnt í 0,16 mg/ml fyrir greiningu með CD litrófsgreiningu.Litrófsskönnun á geisladiskum með bylgjulengd 185 til 260 nm var safnað á Jasco J-1500 litrófsmæli með því að nota kvars kúvettur með 1 mm ljósleiðarlengd (Helma) við 25°C á hraðanum 50 nm/mín.CD litrófið var leiðrétt við grunnlínu, meðaltal yfir 10 tökur og breytt í meðaltal afgangs sporöskjustigs (θMRE) í gráðum cm2/dmól:
þar sem MW er mólþungi hvers sýnis í Da;N er fjöldi amínósýra;θ er sporvölustigið í milligráðum;d samsvarar lengd ljósleiðar í cm;styrkur próteina í einingum.