347 ryðfríu stáli spólulaga efnahluti, auðkenning nýrra interferónssvarandi manna hvítfrumna mótefnavaka-A (HLA-A) chaperone prótein með krosstengdri massagreiningu (CLMS)

Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Þú ert að nota vafraútgáfu með takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Að auki, til að tryggja áframhaldandi stuðning, sýnum við síðuna án stíla og JavaScript.
Rennistikur sem sýna þrjár greinar á hverri glæru.Notaðu til baka og næsta hnappa til að fara í gegnum glærurnar, eða rennibrautarhnappana í lokin til að fara í gegnum hverja glæru.

Vörulýsing

Ryðfrítt stál 347L spólurör, stálflokkur: SS347L

Interferónboðakerfið framkallar sterka cýtókínsvörun við fjölmörgum sjúkdómsvaldandi og innri meinafræðilegum merkjum frá umhverfinu, sem leiðir til örvunar undirhópa interferónsörvandi próteina.Við beittum DSS-miðluðum krosstengdum massagreiningum (CLMS) til að greina nýjar prótein-prótein víxlverkanir á sviði interferón-framkallaðra próteina.Til viðbótar við væntanleg interferón-örvandi prótein, auðkenndum við einnig nýjar millisameinda- og innansameinda krosstengdar adducts af kanónískum interferón-örvandi próteinum eins og MX1, USP18, OAS3 og STAT1.Við lögðum áherslu á hornrétta staðfestingu á nýju setti interferón-framkallanlegra próteinakerfa sem myndast af HLA-A próteinum (H2BFS-HLA-A-HMGA1) með því að nota samónæmisútfellingu og frekari rannsókn þeirra með því að nota sameindavirkni líkanagerðar.Líkanagerð á sköpulagsvirkni próteinfléttunnar leiddi í ljós nokkra víxlverkunarstaði sem endurspegluðu víxlverkanirnar sem greindust í CLMS niðurstöðunum.Saman kynnum við tilraunarannsókn á CLMS til að bera kennsl á nýja merkjafléttur af völdum interferóns, og hlökkum til víðtækari notkunar CLMS til að bera kennsl á nýja gangverki próteinsamskipta í örumhverfi æxlis.
Áður en aðlögunarhæft ónæmissvörun hefst, vekur meðfædda varnarkerfi hýsilsins örverueyðandi svörun sem miðlað er af fjölskyldu seyttra alfa-heilískra cýtókína sem kallast interferón (IFN).IFN-flokkar af gerð I IFNα og IFNβ virkja frumuviðbrögð, þar með talið veirueyðandi, frumudrepandi, bólgueyðandi og fjölgunarhemjandi ástand.Hjá mönnum eru 13 undirgerðir af IFNα þekktar, allar í þyrpingum á litningi 91. Það kemur á óvart að aðeins IFNα2 hefur verið rannsakað til klínískrar notkunar.Undanfarið hefur sérstaka athygli verið lögð á rannsóknir á öðrum undirtegundum IFNα.Nýleg rannsókn sýndi að IFNα14 er eitt áhrifaríkasta ísóformið til að takmarka HBV2 og HIV-13,4 afritunar samanborið við kanóníska IFNα2 undirgerðina.
Það hefur verið sýnt fram á að virkjaðir interferónviðtakakomplexar af tegund I (IFNAR1 og IFNAR2) koma af stað merkjaflutningsfalli sem miðlað er af Janus kínasa TYK2 og JAK15,6.Þessir Janus kínasar fosfórýlat merkjaboða og umritunarpróteinvirkja (STAT1 og STAT2) á týrósínleifum til að hefja SH2 lénsmiðlaða heterodimerization6.Í kjölfarið binst IRF9 STAT heteródímer til að mynda þrímera flókið IFN-örvaðs þáttar 3 gensins (ISGF3), sem færist yfir í kjarnann og framkallar umritun yfir 2000 interferón-örvaða gena (ISGs)5,6,7,8.
ISGs mynda burðarás hins meðfædda ónæmiskerfis, sérstaklega sem svar við veiruárás.Sem fyrsta varnarlína gegn veirusýkingu beita frumur hratt umfangsmiklum samskiptum frumupróteina með fjölbreyttri líffræðilegri starfsemi.Þessi prótein innihalda mynsturþekkingarviðtaka, merkjasameindir, umritunarþætti og prótein með beina veirueyðandi virkni, auk neikvæðra stjórna ónæmissvörunar9.Mikið af upplýsingum um ISG-virkni kemur frá virkniskimum þar sem notaðar eru yfirtjáningarskjáir10,11 eða genþagnartækni (siRNA, RNAi og CRISPR)12,13 þar sem einstök ISG eru tjáð eða hindrað og virkni þeirra er prófuð á ýmsum vírusum.Þrátt fyrir að þessar rannsóknir hafi ákvarðað veirueyðandi eiginleika einstakra ISGs, eru undirliggjandi sameindakerfi hvers ISG að mestu óþekkt.Það er almennt viðurkennt að mörg prótein hafa samskipti við eitt eða fleiri frumufrumur til að tryggja fulla virkni, þannig að annað hvort hafa ISG bein samskipti eða samskipti þeirra eru miðlað af frumupróteinum.Til dæmis benti nýleg photocrosslinked próteomics rannsókn ATPase VCP/p97 sem helsta IFITM3 samspilsaðila, þar sem hömlun hans leiðir til galla í lysosomal flokkun, veltu og samflutningi IFITM3 með veiruögnum 14 .Með því að nota ónæmisútfellingu, auðkenndum við VAPA, prótein sem tengist blöðrum, sem víxlverkunaraðila við IFITM1/2/3 sem miðlar kólesterólmiðluðum veiruþroska, og þetta var staðfest með annarri rannsókn þar sem ger tveggja blendingakerfi var notað.Vísindalegur stuðningur 15 , 16 .
Grundvallar líffræðilegt ferli sem tekur þátt í bælingu á sýkingu og illkynja umbreytingu er mótefnavakakynning, sem miðlað er af helstu vefjasamrýmanleika (MHC) sameindum.Peptíð (8-12 amínósýrur að lengd) úr klofnum, ótímabært stöðvuðum eða misbrotnum próteinum eru hlaðið inn í MHC-I heteródímerinn (sem samanstendur af MHC-I þungum og léttum keðjum, sem kallast β-2-microglobulin; β2M) 17,18.Stöðugar MHC-I trimerar sem myndast eru fluttar á frumuyfirborðið, þar sem þeir kynna innanfrumu peptíð fyrir CD8+ T frumum (frumueyðandi T frumum)17.T frumur þekkja og eyða þessum sýkla og frumum sem bera æxlissértækan mótefnavaka.Þar af leiðandi bæla sýklar og æxlisfrumur oft mótefnavakakynningarferlið til að forðast ónæmiseftirlit.Að auki er MHC-I niðurstýrt í 40-90% æxla í mönnum og er oft tengt lakari horfum19.
Gen sem taka þátt í að bregðast við sýkingum verða að skipta fljótt á milli hvíldarástands og virkrar umritunar.Þess vegna er gert ráð fyrir að nokkur frumuprótein taki þátt í svörun við mikilli eftirspurn eftir IFN á stuttum tíma, þar með talið endurgerð og breytingu á frumukrómatíni 20,21.Flestar rannsóknir hafa beinst að auðkenningu einstakra ISG próteinfélaga í nærveru IFN.Nokkrar prótein- og umritunarrannsóknir í líkanfrumukerfum hafa skýrt áhrif IFN á frumulandslag.Hins vegar, þrátt fyrir vaxandi skilning á gangverki interferóna, vitum við enn lítið um þátttöku ISGs.Þegar hugað er að margbreytileika og tímaháðri gangverki interferónboða vakna tvær spurningar: (i) er hægt að koma á stöðugleika og fanga fjölpróteinflétturnar sem taka þátt í hröðum merkjum og (ii) er hægt að kortleggja þessar víxlverkanir í þrívíddarrými?
Til að takast á við þessi mál innleiddum við disuccinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) ásamt massagreiningu (CLMS) til að rannsaka IFNα-framkallað próteinvíxlverkunarnet og gangverki þess.DSS bætir við samgildum tengjum á milli nærliggjandi leifa próteina og/eða próteinfléttna in vivo.Síðari MS-greining leiðir í ljós ákveðna þvertengingarstaði sem endurspegla staðbundna nálægð svæða innan tiltekins próteins, sem kallast innri tengingar, eða undireiningar í próteinfléttum, sem kallast innbyrðis tengsl.Með því að nota þessa nálgun höfum við greint nokkra nýja prótein-próteinfléttur sem og interferón-framkallaða fjölpróteinvíxlverkunarnet.Með því að prófa frekar undirmengi þessara nýju milliverkana sýnum við fram á að H2BFS (H2B histon-gerð FS; hér eftir nefnt H2B) og MDN1 virka sem bindandi samstarfsaðilar fyrir HLA-A.
Flo-1 frumur eru eitt þekktasta in vitro líkanið af kirtilkrabbameini í vélinda þar sem þær líkja eftir lykileinkennum vélindaæxla22,23.Hins vegar eru ekki öll æxli ónæmisvaldandi og til að ákvarða hvort Flo-1 frumur bregðast við interferónmeðferð, meðhöndluðum við Flo-1 frumur með 10 ng/ml IFNα í 72 klst.Flo-1 frumur sýndu snemma örvun pSTAT1 og IRF1, byrjaði 2 klukkustundum eftir meðferð og hélt áfram í 72 klukkustundir, með tímaháðri lækkun á kyrrstöðu IRF1 (Mynd 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2 og ISG15) reyndust vera sterklega framkölluð eftir 6 klukkustundir, sem líkja eftir klassískum mið- og síðfasaviðbrögðum við IFNα (mynd 1A).Saman benda þessi gögn til þess að hægt sé að nota þetta frumulíkan til að rannsaka interferónsvörun.
Mismunandi próteintjáningarsvörun í Flo-1 frumum eftir IFNα meðferð.(A) Próteintjáning í Flo-1 frumum sem voru meðhöndlaðar með 10 ng/ml IFNα í 2, 6, 24, 48 og 72 klukkustundir var greind með ónæmisblóði með því að nota tilgreind ISG mótefni.(B) Coomassie blátt lituð SDS-PAGE hlaup af heilfrumuútdrætti eftir krosstengingu við DSS fyrir tilgreinda tíma og styrk.(C) Fulltrúi ónæmisblóðs skoðuð með p53(DO-1) mótefni úr sömu sýnum til að meta hversu mikið prótein krosstenging er.
Til að fanga landslag próteinvíxlverkunar á staðnum notuðum við DSS, sem er mikið notaður krosstengiefni vegna mikillar himnu gegndræpis og tiltölulega stutts viðbragðstíma.Styttri viðbragðstími hjálpar til við að koma í veg fyrir myndun stórra samsafna þvertengdra próteina og viðheldur þar með stöðugleika þvertengdarefnisins.Til að ákvarða ákjósanlegan DSS styrk og forðast ofþvertengingu, útsettum við frumurnar fyrst fyrir 5, 2,5 og 1 mM DSS í 5, 10, 5 og 30 mínútur, í sömu röð, og greindum lýsötin með Coomassie-lituðum SDS-PAGE (gögn ekki sýnd).Frumulýsi virðast vera mjög krosstengd við lægsta styrk og á stysta tímapunkti.Þess vegna var DSS títrað í 1, 0,5 og 0,1 mM á 5 mínútum (Mynd 1B).Ákjósanlegur krosstenging sást með 0,5 mM DSS í 5 mínútur, og þessi skilyrði voru valin fyrir frumur sem voru meðhöndlaðar með IFNa.Að auki sýnir mynd 1C Western blot sem er gert með því að nota p53 (DO-1) mótefnið til að meta hversu mikið prótein krosstengingar eru.
Flo-1 frumur voru meðhöndlaðar með 10 ng/ml IFNa í 24 klukkustundir áður en krossbindaranum var bætt við.Krosstengdar frumur voru í kjölfarið greindar með tveggja þrepa próteingreiningu og prótein unnin með FASP (Mynd 2)24,25.Krosstengd tryptic peptíð voru greind með massagreiningu (mynd 2).MS/MS litrófið er síðan passað við próteinröðina og magnmælt með MaxQuant26,27.Krosstengd peptíð voru auðkennd úr rófunum sem fengust með því að nota SIM-XL forritið og einstök efnasambönd voru sameinuð í flókið net með því að nota xQuest28 og SIM-XL29 opinn uppspretta tölvuhugbúnaðarleiðslur (mynd 2).SIM-XL auðkennir prótein-prótein víxlverkanir, innri keðjur og einstakar keðjur í einföldum eða flóknum próteinblöndur og veitir forskriftir til að sjá víxlverkanir í próteinbyggingum.Að auki raðar það hverri krosstilvísun sem auðkennisstig í samræmi við MS/MS29 litrófsgæði.Nokkrar mjög áreiðanlegar prótein-prótein víxlverkanir og fléttur hafa verið auðkenndar og nýtt mengi víxlverkana hefur verið rannsakað frekar með því að nota samónæmisútfellingu og formbreytingar á fléttum með því að nota sameindavirkni (MD) líkan (mynd 2) 30, 31.
Skýrt yfirlit yfir CLMS aðferðina.Flo-1 frumur voru meðhöndlaðar með 10 ng/ml IFNα í 24 klukkustundir, fylgt eftir með prótein krosstengingu á staðnum með því að nota DSS, fylgt eftir með frumugreiningu og trypsínvæðingu.Krosstengd sýni voru greind með Orbitrap massarófsmæli og tekin frekar sýni til að sundra forverum peptíðs við LC-MS/MS.Tvö tengd peptíð voru auðkennd úr litrófinu sem fengust með því að nota Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL) forritinu og öll efnasamböndin voru sameinuð í flókið net með því að nota reiknileiðslur.Sía út milliverkanir með lágt sjálfstraust byggt á stigum um rangt jákvætt hlutfall (FDR).Nokkrar nýjar hágæða prótein-próteinvíxlverkanir voru staðfestar enn frekar með því að nota samónæmisútfellingu og sköpulagsbreytingar á fléttunum voru skoðaðar með því að nota sameindavirkni (MD) líkan.
Alls greindust ~30.500 og ~28.500 peptíð með því að nota MaxQuant í óörvuðum og örvuðum IFNα sýnum, í sömu röð (viðbótartafla S1, mynd 3A).Lengdardreifing peptíðs í báðum tilfellum sýndi hærra hlutfall stærri peptíða, sem gefur til kynna að krosstengd peptíð séu til staðar (mynd 3B, C).Að auki var stærra hlutfall af stærri peptíðum til staðar á bilinu 40-55 í IFNα-meðhöndluðum sýnum (mynd 3C).Próteinkortlagning gegn log2 styrkleika sýndi að klassísk interferónörvuð prótein voru algengust samanborið við ómeðhöndluð sýni, þar á meðal MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 og HLA-F (mynd 3D).Greining á ferlum fyrir prótein meira en þrefalt auðgað sem svar við IFNα meðferð með því að nota Reactome ferla gagnagrunninn sýndi að MHC-I miðluð mótefnavaka framsetning og vinnsla var mest ráðandi leiðin (Mynd 3E).Í samræmi við fyrri skýrslur voru veirueyðandi svörun sem miðlað var af OAS og ISG15 auk IFNα/β og cýtókínboða meðal þeirra leiða sem virkjaðar voru.Að auki voru lýsín- og serínsértæk prótein krosstengingar auðkennd frá upphaflega áunnum MS/MS litrófinu með SIM-XL.Nýleg rannsókn greindi frá 104 ISG sem spanna 20 vírusa úr 9 vírusflokkum með safngreiningu á einstökum ISG oftjáningarrannsóknum í 5 frumutegundum9.Hins vegar, til að sigrast á reiknitakmörkunum við að skima stór gagnasöfn, byrjuðum við með smærri gagnasöfn til að kanna möguleg samskipti milli listans yfir IRDS gena sem Padaria o.fl. greinir frá, sem flest eru ISG.
Auðkenning á mistjáðum krosstengdum próteinum sem svar við IFNα (gögn fengin frá MaxQuant).(A) Venn skýringarmynd sem sýnir fjölda algengra og einkapeptíða sem eru auðkennd í IFNα14 meðhöndluðum og ómeðhöndluðum Flo-1 sýnum.Peptíðlengdardreifing ómeðhöndlaðra (B) og IFNα-meðhöndlaðra (C) krossbundinna sýna.(D) Hitakort sem táknar log2 (LFQ styrkleiki) milli ómeðhöndlaðra og IFNα14 meðhöndlaðra Flo-1 fruma.Vinstra spjaldið sýnir próteinin sem eru virkast virkjuð í nærveru IFNα.(E) Vefrit sem táknar 20 helstu auðgunarleiðir eftir IFNα meðferð.Gagnagrunnur Reactome ferla greindi meira en fjórfaldar breytingar á uppstýrðum IFNα-svarandi próteinum.
Interferon-miðluð ISG örvun er vel skjalfest, en á sameindastigi er illa skilið hvernig þessi prótein ná hámarki í margvíslegum líffræðilegum aðgerðum.Við rannsökuðum próteinvíxlverkanir með miklu öryggi milli þekktra ISGs.Athyglisvert er að við greindum net sem inniheldur MX1, USP18, ROBO1, OAS3 og STAT1 prótein sem mynda stóra flókið sem svar við IFNα meðferð (Mynd 4, Tafla S2) 32,33,34.Mikilvægast er að þessar milliverkanir fundust í öllum þreföldum meðferðum með IFNα og fundust ekki í ómeðhöndluðum sýnum, sem bendir til þess að þær hafi myndast sérstaklega sem svar við IFNα meðferð.Það er vitað að STAT1 stýrir tjáningu þessara ISGs með umritun en samskipti þess við ISGs á próteinstigi hafa ekki verið rannsökuð.Kristalbygging STAT1 sýndi að helical domain (CCD) þess tekur ekki þátt í samskiptum við DNA eða frumefni við myndun dimera35.Þessar α-þyrlur mynda þyrillaga uppbyggingu sem veitir að mestu vatnssækið yfirborðssvæði til að víxlverkanir geti átt sér stað 35 .Í CLMS gögnum okkar sáum við að flest samskiptin við STAT1 áttu sér stað í SH2 léninu á undan CCD, tengiléninu eða C-enda hala (leifar 700-708) (Mynd 4A).Fyrri rannsókn greindi frá því að USP18 binst CCD og DNA-bindandi léni (DBD) STAT2 og er ráðinn í undireiningu interferónviðtaka IFNAR2 af tegund I til að miðla hömlun á interferónboðum af tegund I 24 .Gögnin okkar sýndu einnig að USP18 hvata lénið hefur samskipti við STAT1 DBD (Mynd 4A, D), sem bendir til þess að bæði STAT1 og STAT2 gætu gegnt hlutverki í að laða USP18 að IFNAR2.
Prótein-prótein ISG net auðkennt í krosstengdum frumum sem meðhöndlaðar eru með IFNα.(A) 2D víxlverkunarrit sem sýnir prótein-prótein víxlverkanir (mynduð í SIM-XL forritinu), með línum sem tákna víxlverkanir milli sameinda (crosslink cutoff stillt á 3,5).Lén með mismunandi auðkenni eru merkt með lit32: MX1 léni, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) og GED (569–660).OAS3 lén: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) og OAS1_C (903-108).Lén ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) og fn3 (777–864).STAT1 reitir: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) og STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Hringlaga áhorfandi af krosstengdum próteinum (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 og STAT1) með milliverkanir og milliverkanir merktar með bláu og rauðu, í sömu röð.Þröskuldur krosstengingar var stilltur á 3,5.Punktaplot gefa til kynna STAT1 víxlverkunarstaði við MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) og OAS3 (F), auk K eða S víxlverkunarstaða milli peptíðanna tveggja.Á myndinni er þröskuldur krosstengingar settur á 3,0.(G) Ýmsir víxlverkunarstaðir á milli STAT1 og OAS3 DI léna ofan á próteinbyggingu þeirra í PyMol (PyMOL sameindagrafíkkerfi, útgáfa 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb auðkenni: 1bf533) og OAS3 (pdb auðkenni: 4s3n34).) forrit.
Tveimur ísóformum USP18 hefur verið lýst í mönnum, próteini í fullri lengd sem er aðallega staðsett í kjarnanum og ísóformi án N-enda léns, USP18-sf, sem dreifist jafnt í umfrymi og kjarna 36 .Að auki var spáð að N-endanum væri ómótað og krefst ekki ísópeptíðasavirkni eða ISG1537-bindingar.Flestar víxlverkanirnar sem greindust í rannsókn okkar voru staðsettar á N-enda próteins, sem bendir til þess að þessar víxlverkanir feli í sér USP18 í fullri lengd (Mynd 4A,D) og eiga sér því líklega stað í kjarnanum.Þar að auki benda gögn okkar einnig til þess að N-endinn sé sérhæfður fyrir prótein-við-prótein samskipti.IFNAR2 bindistaðurinn er staðsettur á milli leifa 312-368, og sérstaklega, ekkert af próteinum í flóknum binst þessu svæði (Mynd 4A) 37,38.Þessi gögn tekin saman benda til þess að IFNAR2 bindisvæðið sé eingöngu notað af viðtakapróteininu.Að auki reyndust aðeins OAS3 og ROBO1 tengjast lénum fyrir ofan N-enda og IFNAR2 bindisstað (Mynd 4A).
ROBO1 tilheyrir immúnóglóbúlíni (Ig) ofurfjölskyldu transhimnumerkjasameinda og samanstendur af fimm Ig lénum og þremur fibronectin (Fn) lénum á utanfrumusvæðinu.Þessum utanfrumu lénum er fylgt eftir með himnu-proximal svæði og einn transhimnu helix 39. Ómótað innanfrumu svæði er staðsett á C-endanum og inniheldur varðveitt röð mótíf sem miðla áhrif próteinbindingu39.Svæðið sem nær frá amínósýrum ~1100 til 1600 er að mestu röskun.Við komumst að því að MX1 hefur samskipti við ROBO1 í gegnum Ig, Fn og innanfrumu lén, á meðan flestar samskipti við STAT1 eiga sér stað á milli CCD, tengisvæðis þess og C-enda ROBO1 (mynd 4A, E).Á hinn bóginn voru samskipti við DI, DIII og OAS3 tengisvæði dreift um ROBO1 próteinið (mynd 4A).
Ólígoadenylat synthasa (OAS) próteinfjölskyldan tekur við og binst innanfrumu tvíþátta RNA (dsRNA), breytist í sköpulag og myndar 2′,5′-tengd oligoadenylate (2-5 As) 40 .Það kom í ljós að meðal þriggja OAS, sýnir OAS3 mesta sækni í dsRNA og myndar minnst magn af 2-5 As, sem getur virkjað RNase L og þar með takmarkað veiruafritun 41 .OAS fjölskyldan samanstendur af pólýmerasa beta (pol-β)-líkum núkleótíð transferasa lénum.Fyrri rannsóknir hafa sýnt að hvatavirkni C-enda lénsins (DIII) er háð dsRNA-bindandi léninu (DI), sem er nauðsynlegt fyrir virkjun OAS342.Við sáum að DI og DII lén OAS3 hafa samskipti við CCD og lítið mótasvæði milli SH2 og STAT1 TAD (Mynd 4A, F).Yfirbygging mismunandi crosslinking staður á prótein uppbyggingu leiddi í ljós víxlverkun milli β-blaðsins og DBD STAT1 lykkju og opinn vasa eða hola sem myndast af leifum 60-75 í DI léni OAS3 (mynd 4G).Stefna próteina í samstæðunni benti einnig til þess að engin af víxlverkunum við OAS3 truflaði DNA-bindingargetu DI léns þess (mynd S1A).Að auki hefur N-enda lén GTPase MX1 mikil samskipti við DI og DIII lén OAS3 (mynd 4A).Við sáum einnig víxlverkun milli OAS1 og MX1 í öllum þremur IFNα-meðhöndluðum endurtekningum, þar sem eitt OAS1 lén (einnig hvatavirkt) hafði samskipti við öll þrjú MX1 lénin (Mynd S2A,B).
MX prótein eru hluti af stórri fjölskyldu dyneinlíkra GTPasa sem innihalda N-enda GTPase lén sem bindur og vatnsrofnar GTP, millisvæði sem miðlar sjálfsamsetningu og C-enda leucine rennilás sem virkar sem GTPase (LZ) ).lénsáhrifa lén25,43.MX1 binst undireiningum veirupólýmerasa til að hindra umritun á veirugeninu43.Áður tilkynnt ger tveggja blendinga skjár sýndi að PIAS1 tengdur MX1 ​​hindrar STAT1 miðlaða genavirkjun með því að hindra DNA bindandi virkni og hefur einnig SUMO E344,45 lígasa virkni.Hér sýnum við fram á að MX1 binst STAT1 (Mynd 4C, D), en hvernig þessi víxlverkun hefur áhrif á STAT1-miðlaða genavirkjun sem svar við IFNα þarf frekari rannsókn.Að auki komumst við einnig að því að MX1 hafði samskipti við IFIT3 og DDX60 í öllum þremur IFNα-meðhöndluðum endurtekningum (mynd S2C).
DDX60 er IFN framkallaður umfrymishelikasi sem áður hefur verið greint frá að gegni hlutverki í RIG-I óháðu niðurbroti veiru RNA46.Það hefur samskipti við RIG-I og virkjar merkjasendingar þess á bindilsértækan hátt 46. DDX60 samanstendur af DEXD/H-Box helicasa léni og C-enda helicase domain sem bindur veiru RNA og DNA47.Flest samskipti þess við MX1 og IFIT3 eiga sér stað á löngum N- og C-endasvæðum án kanónískra léna eða mótífa (mynd S2E, F).Hins vegar er MX1 ​​einnig tengt DEXD/H-Box helicase léninu (mynd S2E).Prótein af IFIT fjölskyldunni hafa samhliða afrit af áberandi helix-turn-helix mótíf sem kallast tetrapeptide repeat (TPR).IFIT3 reyndist vera jákvæður mótari RIG-I merkja og þar af leiðandi hluti af MAVS flókinu.Samanlagt benda gögn okkar til þess að IFIT3 og DDX60 hafi samskipti fyrst og fremst á svæðinu á milli TPR 3-6 af IFIT3 og gætu gegnt hlutverki í RIG-I/MAVS merkjasendingum (mynd S2F).
Í ljósi þess að skimun á öllu próteóminu er reikningsfrek, skimuðum við síðan allan UniProt gagnagrunn mannsins fyrir tilvist einnar af endurtekningunum sem fengu IFNα.Í þessari eftirmynd fundum við nokkur mjög áreiðanleg samskiptanet fyrir HLA-A.Greining á próteinferlum sem auðkenndar eru af MS/MS litrófinu sýndu að MHC-I-undirstaða mótefnavakavinnsla og framsetning er aðalferillinn sem interferón veldur (mynd 3D).Þess vegna lögðum við áherslu á að rannsaka próteinvíxlverkanir MHC-I sameinda með miklu öryggi í öllum krosstengdum sýnum.HLA samanstendur af α1, α2 og α3 lénum og léttum keðjum og míkróglóbúlín β2 (β2m) er stöðugt chaperone prótein49.Þegar það hefur verið sett saman í endoplasmic reticulum er HLA óstöðugt í fjarveru peptíðbindla50.Peptíðbindandi grópin er mynduð af mjög fjölbreytilegu og ómótuðu α1 og α2 lénunum í ópeptíðformi og tiltölulega minna fjölbreytilega α351 léninu.Í nærveru IFNα fundum við tvær HLA-A fléttur: önnur hefur samskipti við HMGA1 og H2B (Mynd 5, Tafla S3) og hin hefur samskipti við MDN1, LRCH4 og H2B (Mynd 6).
IFNα framkallar HLA-A samskiptanet við H2B (H2BFS) og HMGA1.(A) 2D plot (mynduð í SIM-XL hugbúnaði) sem sýnir mismunandi gerðir af víxlverkunum í H2B-HLA-A-HMGA1 flókinu: millitengill (blár), millitengur (rauður) og stakur hlekkur (svartur)..Lén með mismunandi auðkenni eru litakóða32: H2B (histón; 2–102) og MHC-I (MHC_1; 25–203, hópur C1; 210–290 og MHC_I_C; 337–364).Þröskuldur krosstengingar var stilltur á 3,5.Punktaplot gefa til kynna HLA-A víxlverkunarstaði við H2B (B) og HMGA1 (C), auk K eða S víxlverkunarstaða milli peptíðanna tveggja.Á myndinni er þröskuldur krosstengingar settur á 3,0.(D) Tengsl próteina sem sýnd eru í uppbyggingu H2B, HLA-A og HMGA1 próteina í PyMOL forritinu.Þessar mannvirki voru mótaðar með því að nota Phyre2 netþjóninn (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) og sniðmátsbyggingin fyrir H2B, HLA-A og HMGA1 próteinin voru 1kx552, 1kj349 og 2eze55, í sömu röð.
IFNα framkallar HLA-A samskiptanet við H2B (H2BFS), MDN1 og LRCH4.(A) Innansameinda (rauð) og millisameinda (blár) krosstengingar sýndar á 2D gagnvirku korti (myndað í SIM-XL hugbúnaði) með MDN1 táknað sem hring.Þröskuldur krosstengingar var stilltur á 3,5.Lén með mismunandi auðkenni eru litakóða32: H2B (histón; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, hópur C1; 210–290 og MHC_I_C; 337–364) og LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) og CH (535–641)).(B) Tengsl próteina sem sýnd eru í uppbyggingu H2B, HLA-A, LRCH4 og MDN1 próteina í PyMOL forritinu.Þessar mannvirki voru mótaðar með því að nota Phyre2 netþjóninn (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) með sniðmátsbyggingum 1kx552, 1kj349, 6hlu62 og 6i2665 fyrir H2B, HLA-A, LRCH4 og MDN1 próteinin, í sömu röð.Punktallot sem sýnir K eða S víxlverkunarstaði fyrir HLA-A við H2B (C), LRCH4 (D) og MDN1 (E).Fyrir lóðir var þröskuldur krosstengingar settur á 3,0.
Auk þess að viðhalda heilleika erfðamengsins tekur histon H2B einnig þátt í stjórnun umritunar.H2B próteinið samanstendur af miðlægu histónsvæði (HFD) sem er myndað af þremur α-þyrlum aðskildum með lykkjum og C-enda hala 41,52.Mest af víxlverkuninni við H2B á sér stað í α1 helix, sem veitir trimerization með HFD heterodimer (mynd 5A,B).Þrátt fyrir að lýsín taki þátt í DNA-bindingu eru sum lýsín einnig önnur asetýlerunar- eða metýleringarstaður.Til dæmis eru leifar K43, K46 og K57 frá H2B ekki þátt í beinni DNA-bindingu, en eru skotmark ýmissa breytinga eftir umritun53.Á sama hátt geta leifar K44, K47 og K57 í H2B gegnt öðru hlutverki í nærveru IFNa, þar með talið milliverkanir við önnur prótein (mynd 5A, B).Að auki virkjar utanlitningahistónið H2B ónæmissvörun í ýmsum frumugerðum og virkar sem frumuskynjari til að greina tvíþátta DNA (dsDNA) brot sem eru unnin úr smitefnum eða skemmdum frumum54.Í nærveru DNA vírusa hamlaði H2B eyðing IFN-β framleiðslu og STAT154 fosfórun.H2B er einnig þekkt fyrir að fara inn og út úr kjarnanum hraðar en önnur kjarnahistón54.H2B milliverkanir við MDN1 og LRCH4 komu einnig fram í völdum ómeðhöndluðum sýnum.Við komumst að því að HLA-A hafði samskipti við H2B í öllum þremur IFNα-meðhöndluðu sýnunum og í einu ómeðhöndluðu endurteknu sýni.Þessi gögn endurspegla hlutverk H2B í annarri lífeðlisfræðilegri virkni óháð umritunarstjórnun.
HMGA1 (High Mobility Group AT-Hook 1), lítið kjarnaprótein sem er ríkt af sjúkdómshvetjandi amínósýrum, hefur verið auðkennt í tengslum við HLA-A.Það hefur súrt C-enda hala og þrjá aðskilda DBD sem kallast AT krókar vegna þess að þeir bindast við minniháttar gróp AT-ríka svæðisins í dsDNA55,56.Þessi binding veldur því að DNA beygist eða réttist, sem gerir kanónískum umritunarþáttum kleift að fá aðgang að samhljóða röð þess.Talið er að C-enda skottið taki þátt í prótein-próteinvíxlverkunum og nýliðun umritunarþátta, þar sem C-enda eyðingarstökkbrigði geta ekki komið af stað umritun57.Þar að auki inniheldur þetta lén nokkra varðveitta fosfórunarstaði sem eru þekkt hvarfefni fyrir kínasa 58 .Við sáum HLA-A og H2B samskipti við HMGA1 utan C-enda lénsins, sem bendir til þess að C-enda lénið sé aðallega notað fyrir umritunarþáttabindingu (mynd 5A, C).HMGA prótein keppa við histon H1 um að bindast við millistykki DNA og auka þar með aðgengi57.Á sama hátt virðist líklegt að HMGA hafi samskipti við histón H2B meðfram tengil DNA í samkeppni við histon H1.HMGB1 örvar tjáningu á HLA-A, -B og -C í dendritic frumum, sem leiðir til virkjunar þeirra59, en víxlverkun milli HMG og HLA hefur ekki áður verið tilkynnt.Við komumst að því að HMGA1 hefur samskipti við α1 og α3 lén HLA-A, með flestum víxlverkunum utan 3 DBD þess (Mynd 5A, C).Í okkar höndum kom í ljós að HLA-A var staðbundið í kjarnanum (gögn ekki sýnd) og í ljósi þess að H2B og HMGA1 eru einnig til staðar í kjarnanum, þá á þessi víxlverkun sér líklega stað í kjarnanum.Sérstakar aukaefni sem mæld eru á milli H2B, HLA-A og HMGA1 eru sýnd á mynd 5D.
Flestar víxlverkanir HLA-A við önnur prótein eiga sér stað innan α1 og α2 léns þess og óreglulega C-enda lénsins (mynd 6).Í einu af þessum dæmum komumst við að því að HLA-A hefur samskipti við röskaðan N-enda hala LRCH4 (Mynd 6A,D).LRCH4 stjórnar TLR4 virkjun og LPS cýtókínörvun og mótar þannig meðfædda ónæmissvörun60,61.Það er himnuprótein með níu leusínríkum endurtekningum (LRR) og calmodulin (CH) samlíkingu mótíf í ectodomein þess, fylgt eftir með transmembrane domain (TMD) 60 , 62 .Tilkynnt hefur verið um að CH lén miðli milliverkanir próteina og próteina 60 .Um það bil 300 amínósýrur á milli LRR og CH lénanna eru tiltölulega aðgengileg en óregluleg.Byggt á virkni trufluðra svæða sem miðlara prótein-próteinneta og blöðruflutninga 63, komumst við að því að flestar próteinsamskipti eiga sér stað á röskuðum svæðum.Milliverkanir við MDN1 voru dreifðar um lengd próteinsins, þar með talið LRR1, LRR6, CH lénin og tilviljunarkennd svæði, en H2B bundist aðallega CH léninu (mynd 6A, B).Sérstaklega, engin af milliverkunum innihélt TMJ, sem bendir til sérstöðu CLMS nálgunarinnar (Mynd 6A, B).
MDN1 hefur einnig verið skilgreint sem hluti af HLA-A prótein netinu (Mynd 6A).Það tilheyrir AAA fjölskyldu próteina (ATPases sem tengjast mismunandi starfsemi).Þetta er sama N-enda AAA lénið sem flokkast í sexamerískan hring og fjarlægir samsetningarþáttinn úr 60S 64 ríbósóma undireiningunni.virðist vera svipað og dynein64,65,66.Að auki er Asp/Glu ríku svæðinu fylgt eftir af MIDAS léninu (málmjón háð staður).Vegna stórrar stærðar MDN1 (u.þ.b. 5600 amínósýrur) og takmarkaðrar samlíkingar við vel rannsökuð prótein er lítið vitað um uppbyggingu þess og virkni í mönnum.Við greindum HLA-A, H2B og LRCH4 sem MDN1 bindandi samstarfsaðila og sýndum stefnu þeirra sem próteinfléttur í PyMol (mynd 6A, B).Þessi þrjú prótein hafa samskipti við AAA lénið, dynein-líka tengilénið og hugsanlega MIDAS MDN1 lénið.Í fyrri skýrslu greindi sæknihreinsun beitupróteina MDN1 sem prótein tengt históni H2B67.Að auki greindi nýleg rannsókn einnig frá víxlverkun milli MDN og HLA-B í HCT116 frumum með því að nota sæknihreinsaða massagreiningu, sem styður niðurstöður okkar68.Að bera kennsl á þessa flóknu í IFNα-meðhöndluðum sýnum bendir til hlutverks MDN1 í interferónboðum.
Vegna þess að HLA gen eru mjög fjölbreytileg, tókum við út raðgreiningar sem kortleggja HLA-A, -B og -C úr RNA raðgreiningargögnum Flo-1 frumna (gögn ekki sýnd).Peptíðraðir í samræmi við raðgreiningarlestur sýndu marktækan mun á HLA-A, -B og -C á svæðum þar sem krosstengd peptíð voru staðsett í HLA-A (Mynd S3).Að auki sáum við ekki prótein-í-prótein krosstengingu HLA-B/C sameinda við H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 prótein.Þetta bendir til þess að próteinvíxlverkunin sem finnst á milli HLA-A, MDN1, LRCH1 og HMGA1 sé HLA-A sértæk.Að auki sýndi próteingreining á ótengdum sýnum (tafla S4) að HLA-A hefur meiri raðþekju samanborið við HLA-B eða HLA-C.Peptíðin sem greind voru fyrir HLA-A voru mikil í styrkleika bæði í IFNα-meðhöndluðum og ómeðhöndluðum sýnum.
Til að tryggja að víxlverkunin sem bent er á hér væri ekki vegna ósértækrar krosstengingar tveggja próteina í nálægri staðbundinni nálægð, staðfestum við enn frekar tvo nýja HLA-A víxlverkandi þætti með því að framkvæma sam-ónæmisútfellingarprófanir.HLA-A milliverkanir við innræna MDN1 og H2B greindust bæði í IFNα-meðhöndluðum og ómeðhöndluðum Flo-1 frumum (Mynd 7, Mynd S4).Við staðfestum að HLA-A var fangað af H2B í ónæmisútfellingunum og að þetta samband væri vegna IFNα meðferðar þar sem HLA-A var fjarverandi í ónæmisbotnfallssýnunum úr ómeðhöndluðum frumum (Mynd 7A).Hins vegar benda gögn okkar til þess að IFNα stýri HLA-A bindingu við H2B og MDN1 á mismunandi hátt.IFNα framkallar tengsl milli H2B og HLA-A, en dregur úr tengslum þess við MDN1.Við komumst að því að MDN1 var tengt HLA-A í viðmiðunarhópum og að bæta við IFNα dró úr þessari víxlverkun óháð MDN1 örvun með IFNα (Mynd 7B, C).Að auki, HLA-A ónæmisútfelling fanga H2B í A549 frumum (mynd S4), sem bendir til þess að þessi milliverkun sé óháð frumugerð.Samanlagt styðja þessar niðurstöður interferónmiðlaðar milliverkanir HLA-A við H2B og MDN1.
HLA-A samhreinsar H2B og MDN1.Fulltrúa innræna H2B (A) og MDN1 (B) ónæmisblettir voru ónæmisútfelldir úr IFNa-meðhöndluðum Flo-1 frumum og rannsakað með tilliti til tilgreindra mótefna.Mús og kanína IgG voru notuð sem neikvæð viðmiðun.(C) Hlutfallslegt magn (inntak) mismunandi mótefnavaka er sýnt með ónæmisblettum sem rannsakaðir eru gegn tilgreindum mótefnum, β-aktín var notað sem hleðslustýring.
Byggingareiginleikar eins af interferónvöldum mjög áreiðanlegum krosstengdum netum, H2B-HLA-A-HMGA1, voru rannsakaðir.Við notuðum sameindavirkni líkanagerðar sem aðra nálgun til að skilja sköpulagsvirkni próteina sem taka þátt í þessari flóknu (Mynd 8).Ályktanir frá CLMS gögnum benda til möguleika á mismunandi sköpum H2B, HLA-A og HMGA1 próteina.Þess vegna voru eftirfarandi mögulegar fléttur gerðar fyrirmyndir í leysiefni: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A og H2B-HLA-A-HMGA1.Upphafleg prótein-prótein tengikví með því að nota MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) pakkann lagði til mögulega sköpulag sem er mismunandi á milli þessara próteina (mynd 8A).Sýning á tengipróteinfléttunni leiddi í ljós nokkrar milliverkanir og mögulega sköpulag (Mynd 5A, 8).Þannig er ein möguleg lögun sýnd á mynd 8A (með merktum krosstengjum) og hún var metin frekar með því að nota MD-líkanaleiðslan.Að auki undirstrikar binding H2B eða HMGA1 við HLA-A meiri sækni H2B í HLA-A (mynd 8A).
Byggingarvirkni mögulegra neta milli H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A og H2B-HLA-A-HMGA1 flétturnar.(A) Vinstri spjaldið er 2D kort (myndað í SIM-XL hugbúnaði) af innansameinda (rauðum) og millisameinda (bláum) krosstengingum (crosslink cutoff stillt á 3,5).Að auki eru auðkenndar krosstengjandi leifar merktar á uppbyggingu H2B, HLA-A og HMGA1 próteina.Tengd sköpulag þessara próteina var dregin út með því að nota tengileiðsluna sem var útfærð í MOE pakkanum.Neðri vinstra spjaldið sýnir ýmsar mögulegar formgerðir H2B-HLA-A og HMGA1-HLA-A fléttanna með mismunandi prótein-prótein bindandi sækni (GBVI/WSA dG; kcal/mól).(B) Staðalfrávik (RMSD) atómstaða (að vetnisatómum undanskildum) fyrir hverja próteinbyggingu.(C) Millisameinda prótein-prótein vetnistengi milliverkanir frá ýmsum hermuðum fléttum að teknu tilliti til sérstakra milliverkana sem vara ≥ 10 ns.H-tengi gjafa-viðtaka skurðarfjarlægð var stillt á 3,5 Å og gjafa-H-viðtaka skurðarhorn var stillt á ≥ 160°–180°.(D) Merktar leifar sem mynda HLA-A prótein-prótein víxlverkanir við viðkomandi samstarfsaðila, sem spannar ≥ 20 ns, dregin út úr dummy HLA-A-H2B og HLA-A-HMGA1 fléttum.Próteinbyggingar tákna meðalbyggingu 100 ns MDS.(E) Milliverkanir milli HLA-A-H2B og HLA-A-HMGA1 fléttna samanborið við milliverkanir sem fylgst er með með H2B-HLA uppgerð yfir 100 ns byggt á K eða S víxlverkunarstaðnum milli peptíðanna tveggja.Fléttur /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Þröskuldsgildi fyrir mat á krosstengingum var stillt á 3,0 og tekið var tillit til sértækra milliverkana frá MDS sem tók ≥ 10 ns.Próteinbyggingar voru sýndar með því að nota BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, Bandaríkjunum) og Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) pakka.
Stöðugleiki HLA-A sameinda með tímanum (staðalfrávik; RMSD eða staðalfrávik; RMSF) benti til þess að tilvist H2B eða HMGA1 próteina í fléttunum stöðvaði HLA-A (Mynd 8B, Mynd S5).HMGA1 próteinið binst þétt við B2M stað HLA-A, sem veldur stöðugleika HLA-A amínósýra í HLA-A-HMGA1 eða H2B-HLA-A-HMGA1 flóknum (Mynd 8B, Mynd S5).einkum reyndust HLA leifar ~60-90 og ~180-210 vera minna sveigjanleg í nærveru H2B (Mynd 8B).H2B og HMGA1 sýndu betri bindingu við HLA-A í H2B-HLA-A-HMGA1 flókinu samanborið við HLA-A bindingu við H2B eða HMGA1 eingöngu (Mynd 8C, D; Tafla S5).Leifar sem taka þátt í vetnisbindingu (MD-líkan mikil umráðafjöldi ≥ 10 ns) falla saman við CLMS-víxlverkunarstaði (K eða S leifar) í samstæðunni, sem bendir til þess að milliverkanirnar sem CLMS greinir séu mjög áreiðanlegar.Áreiðanleiki (mynd 8E).Í CLMS og MD líkanagerð reyndust HLA-A leifar á milli um 190-210 og um 200-220 amínósýrur binda H2B og HMGA1, í sömu röð (Mynd 8E).
Prótein-prótein víxlverkanir mynda kraftmikið burðarnet sem miðla samskiptum innan frumunnar sem svar við ákveðnu áreiti.Vegna þess að margar próteinfræðiaðferðir greina breytingar á almennu jafnvægisstigi próteins, krefjast gangverki próteins og próteina víxlverkunar viðbótarverkfæra til að fanga bindiviðmót, og CLMS er eitt slíkt tæki.Interferónboðakerfið er frumukerfi sem gerir frumum kleift að bregðast við ýmsum sjúkdómsvaldandi og innri meinafræðilegum merkjum í umhverfinu, sem nær hámarki með framkalli undirhópa interferónframkallanlegra próteina.Við beittum CLMS til að ákvarða hvort hægt væri að bera kennsl á nýjar prótein-próteinvíxlverkanir meðal hóps af interferónvöldum próteinum.Hnattræn prótein krosstengingargreining í interferónvirku Flo-1 frumulíkani var notuð til að fanga próteinfléttur.Útdráttur á tryptic peptíðum úr ótengdum og krosstengdum frumum gerir kleift að telja peptíð, auðgun ferla og lengdardreifingu peptíðs með skilgreindum LFQ styrkleika.Kanónísk interferón-örvandi prótein voru auðkennd sem jákvæð innri stjórn, á meðan ný millisameinda- og innansameinda-krosstengd aðlögun kanónískra interferón-örvandi próteina eins og MX1, UP18, OAS3 og STAT1 sáust.Ýmsir byggingareiginleikar og samspil á virknisviðum hafa verið rannsökuð.
Milliverkun milli HLA-A, MDN1 og H2B greindist með ónæmisblettingu í Flo-1 og A549 frumum sem voru meðhöndlaðar og ómeðhöndlaðar með IFNα.Niðurstöður okkar undirstrika að HLA-A fléttur við H2B á IFNa-háðan hátt.Verk okkar eru áhugaverð leið til frekari könnunar á samstaðsetningu þessara tveggja fléttna.Það væri líka áhugavert að víkka út CLMS nálgunina á spjaldið af frumulínum til að bera kennsl á frumugerð óháð interferónmiðluð próteinvíxlverkun.Að lokum notuðum við MD líkanagerð sem aðra nálgun til að skilja sköpulagsvirkni próteina sem taka þátt í H2BFS-HLA-A-HMGA1 flókinu, sem rakti millisameinda og millisameinda krossviðræður.Ályktanir frá CLMS gögnum benda til möguleika á mismunandi sköpum H2BFS, HLA-A og HMGA1 próteina.Möguleg mismunandi sköpulag á milli þessara tengipróteinafléttna leiddi í ljós nokkrar milliverkanir svipaðar þeim sem sjást í CLMS gagnapakkanum.Einn helsti styrkur aðferðar okkar er að hún gerir auðvelt að bera kennsl á víxlverkandi mjög fjölbreytilega gena eins og HLA, svo það verður áhugavert að rannsaka víxlverkanir HLA haplotype-sértækra próteina sem annars er erfitt að rannsaka.Samanlagt sýna gögn okkar að hægt er að nota CLMS til að auka skilning okkar á interferónvöldum merkjakerfum og veita grunn til að rannsaka flóknari millifrumukerfi í æxlisörumhverfinu.
Flo-1 frumur voru fengnar frá ATCC og þeim haldið í DMEM (Gibco) ásamt 1% penicillíni/streptomycini (Invitrogen), 10% fóstursermi nautgripa (Gibco) og geymdar við 37°C og 5% CO2.Ræktun.Frumur voru ræktaðar að 70-80% samruna áður en þær voru meðhöndlaðar með IFNα14 (framleitt af Edinburgh Protein Production Facility).Öll önnur efni og hvarfefni voru keypt frá Sigma Aldrich nema annað sé tekið fram.
Flo-1 frumur voru ræktaðar í 6-brunn plötum og daginn eftir voru frumurnar meðhöndlaðar með 10 ng/ml IFNα14 í 24 klukkustundir til um það bil 80% samruna.Frumur voru þvegnar þrisvar sinnum með PBS og bundnar við nýútbúið DSS (Thermo Fisher Scientific) (leyst upp í DMSO) í PBS í 5 mínútur við 37°C í lokastyrk upp á 0,5 mM.DSS þvertengingarhvarfinu var skipt út fyrir PBS og leifar DSS var slökkt með því að bæta 20 mM Tris (pH 8,0) í PBS í 15 mínútur við 37°C.Frumum var safnað með því að skafa og safnað í glös með litlum bindi (Axygen).
Frumukúllan var leyst með 300 µl af þvagefnislýsibuffi (8 M þvagefni, 0,1 M Tris, pH 8,5) í 30 mínútur við stofuhita með einstaka hristingu.Öll skilvinduþrep voru framkvæmd við 14.000 xg við 8°C.Lýsatið er miðfleytt í 10 mínútur og flotið flutt yfir í nýtt rör.Tæru agnirnar sem eftir voru voru leystar upp í 150 μl af seinni lýsisjafnalausn (2 M þvagefni, 2% (w/v) SDS (natríumdódecýlsúlfat)) í 30 mínútur eða lengur þar til einsleit vatnslausn fékkst.Lysatið var skilið í skilvindu í 20 mínútur og flotinu var blandað saman við lysatið sem fékkst í fyrra þrepi.Próteinstyrkur var metinn með því að nota Micro BCA prófun (Thermo Fisher Scientific) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda um aðgerðir á örplötum.Sýnin voru fljótfryst í fljótandi köfnunarefni og geymd við -80°C.
Um það bil 100 míkrógrömm af leysanlegu krosstengdu próteini voru unnin með því að nota breytta siunarsýna undirbúningsaðferð (FASP) eins og lýst er af Wisniewski o.fl.69 Í stuttu máli er próteinið krossbundið með 200 µl af þvagefnisjafnalausn (8 M þvagefni í 0,1 M Tris, pH 8,5), hringt í hringið og það helmingað.Öll skilvinduþrep voru framkvæmd við 14.000 xg við 25°C.Fyrri helmingurinn af krosstengda próteinlýsatinu var fluttur yfir í 10 kDa Microcon miðflótta síubúnað með Ultracel-10 himnu (Merck), fylgt eftir með skilvindu á síu í 25 mínútur.Bætið síðan seinni hluta próteinsins við síuna og endurtakið sömu skref.Endurheimt próteina var framkvæmd með því að bæta 100 μl af 17 mM tris(2-karboxýetýl)fosfínhýdróklóríði (TCEP) í þvagefnisjafna.Endurheimt var hrært á hitablöndunartæki við 600 snúninga á mínútu í 30 mínútur við 37°C.Að auki var súlan skilin í skilvindu og minnkaða krosstengda próteinið alkýlerað með því að nota 100 μl af 50 mM joðasetamíði í þvagefnisjafnalausn.Alkýlerunarhvarfið var framkvæmt við stofuhita í 20 mínútur í myrkri.Snúðu súlunni, þvoðu súluveggina þrisvar sinnum með 100 µl þvagefnisjafnalausn og skildu síðan.Sama aðgerð var gerð þrisvar sinnum með því að nota 100 μl af 100 mM ammóníumbíkarbónati.Áður en trypsínvæðing er notuð skal skipta um söfnunarrörið fyrir nýtt.Bætið við meltingarjafna sem inniheldur 50 mM ammóníumbíkarbónat og 1 µl trypsín þynnt í trypsínbuffi (Promega).Hlutfalli trypsíns og próteins var haldið í um það bil 1:33 og meltingarhvörf voru ræktuð yfir nótt við 37°C í rakaklefa.Þvertengda peptíðið var skolað úr síunni með skilvindu í 25 mínútur.Endurheimt peptíðs var bætt með því að bæta 50 μl af 0,5 M NaCl við síuna, fylgt eftir með skilvindu í 25 mínútur.
C18 Micro Spin súlur (Harvard Apparatus) voru notaðar til að afsalta krosstengd tryptic peptíð í samræmi við siðareglur sem lýst er af Bouchal et al.70 með smávægilegum breytingum.Í stuttu máli voru C18 snúningssúlur virkjaðar með þremur þvotti af 0,1% maurasýru (FA) í asetónítríl (AcN) (Merck) og tveimur þvotti með 0,1% FA.Súlan var vökvuð með 0,1% FA í 15 mínútur.Settu sýni í snúningssúlur og þvoðu 3 sinnum með 0,1% FA.Afsöltuðu peptíðin voru skoluð í röð með stigskiptum halla með því að nota 50%, 80% og 100% AcN í 0,1% FA.Sýnin voru þurrkuð í SpeedVac Plus þykkni (Eppendorf) þar til afgangsvökvinn hvarf alveg.Skoruðu peptíðin voru leyst upp í 100 μl af 0,08% tríflúorediksýru í 2,5% AcN og styrkurinn mældur á NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Um það bil 1 μg af krossbundnu peptíði í hverju sýni var sprautað í LC-MS/MS kerfið.
Krosstengd peptíð voru aðskilin á UltiMate 3000 RSLCnano LC kerfi (Thermo Scientific) tengt Orbitrap Exploris 480 massarófsmæli (Thermo Scientific).Krosstengdum peptíðum var safnað á 300 µm ID, 5 mm langa µ-forsúlu C18 fangsúlu pakkað með C18 PepMap100 sorbent og 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Hlaðið dæluflæðissettinu á 5 µl/mín. 0,08% tríflúorediksýru uppleyst í 2,5% AcN.Krosstengd peptíð voru aðskilin á greiningarbræddri kísilsúlu með innra þvermál 75 μm og lengd 150 mm, fyllt með 2 μm PepMap ísogsefni (Thermo Scientific).Hreyfanlegur fasi A og B samanstóð af 0,1% FA í vatni og 0,1% FA í asetónítríli, í sömu röð.Halli byrjar á 2,5% B og eykst línulega í 40% B á 90 mínútum, síðan í 90% B á næstu 2 mínútum.Hreyfanlegur fasasamsetning var haldið við 90% B í 10 mínútur og lækkaði síðan línulega í 2,5% B á 2 mínútum.Súlan var sett í jafnvægi við 2,5% B í 8 mínútur fyrir næstu lotu.Krosstengd peptíð sem skoluð voru út úr greiningarsúlunni voru jónuð í nanórafúðajónunargjafa (NSI) og sprautað inn í Exploris 480 massarófsmæli (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 massarófsmælirinn starfaði í jákvæðri gagnafylgniham.Full skönnun var gerð í hlutaham með upplausninni 120.000 með sviðsstillingum frá m/z 350 Th til m/z 2000 Th.Staðlað AGC markmið var stillt á 300% með hámarksinntakstíma 50ms.Einsamsætu toppgreining hefur verið staðfest fyrir peptíð.Slökunarbreytan þvingunar er stillt á satt ef of fáir forverar finnast.Lágmarksjónastyrkur forefnisins var stilltur á 5.0e3 og forverahleðsluástand allt að +8 voru innifalin í tilraununum.
Hringrásartími á milli helstu skanna í gagnafylgniham var stilltur á 2,5 sekúndur.Kvik massaútilokun var stillt á 20 s eftir fyrstu sundrun forverajónarinnar.Einangrunargluggi undanfara var stilltur á 2 þ.Gerð eðlilegrar árekstraorku með fastri árekstraorkuham var valin í gagnaháðri MS/MS skönnun.Árekstursorka stillt á 30%.Orbitrap upplausnin var stillt á 15.000 og AGC markmiðið á 100%.Sérsniðinn hámarks inndælingartími er stilltur á 60 millisekúndur.
Áður en fylgst var með prótein-prótein netinu í krosstengdum sýnum unnum við hráskrárnar með því að nota MaxQuant pakkann (útgáfa 1.6.12.0)26,27 til að bera kennsl á rekjanleg peptíð/prótein í sýnunum.Að auki voru svipaðar próteingreiningar gerðar á ótvítengdum Flo-1 sýnum sem voru meðhöndluð og ómeðhöndluð með IFNα.Leitað var í MS/MS gögnum í UniProt mannagagnagrunninum (www.uniprot.org) (hlað upp 12. ágúst 2020, inniheldur 75.093 færslur) með innbyggðu leitarvélinni Andromeda27.Leitin var framkvæmd án þess að gefa til kynna sérhæfni ensímsins og ýmsar breytingar á afamíðun (N, Q) og oxun (M).Forefnismassavikmörk voru stillt á 20 ppm og afurðajónir á 0,02 Da.Upphafs- og hámarksmassafrávik voru stillt á 10 ppm.Hámarksmassi peptíðsins var stilltur á 4600 Da og raðlíkingin var stillt á milli 7 og 25 amínósýrur (aa).Frekari tölfræðileg greining var gerð með Perseus forritinu (útgáfa 1.6.10.45).Próteininnihald var reiknað út með því að staðla litrófsstyrk próteinsins (LFQ styrkleiki; ómerkt magn)27 og styrkleikagildum var breytt í Log2.Stigveldisþyrping próteina sem auðkennd er með peptíðstyrk þeirra var byggð með því að nota pheatmap (v1.0.12) pakkann í R (v 4.1.2).Ferðaauðgunargreining var framkvæmd með því að nota Reactome ferlagagnagrunninn fyrir IFNα-meðhöndluð prótein sem voru meira en fjórfalt virkjuð samanborið við ómeðhöndluð sýni.
Auðkenning á lýsín (K) eða serín (S) sértækum efnafræðilegum krosstengingum próteinfléttna sem fylgst var með með LC-MS/MS var framkvæmd með litrófsgreiningarvél (SIM-XL) fyrir krosstengd peptíð (SIM-XL)29.Í fyrsta lagi voru mögulegar milliverkanir milli interferóntengdra (IFN) DNA skaðaþols undirskriftargena (IRDS) rannsökuð með því að nota IRDS próteingagnasafnið sem lýst er í Padariya et al.28.Skimun á öllum skilyrðum og endurtekningum á öllu UniProt manneskjunni er tölvufrek, þannig að allur UniProt gagnagrunnur manna (www.uniprot.org) (halað niður 12. ágúst 2020, inniheldur 75.093 færslur) gegn endurteknum IFNα-meðhöndluðum.Ein af síunum fyrir mikil traust samskipti.Þessar mikilvægu milliverkanir sem fengust voru stækkaðar og prófaðar við allar endurtekningar og aðstæður.
Í SIM-XL var DSS notað fyrir crosslinker (XL) og XL þyngdarbreyting og breytingaþyngd var stillt á 138,06 og 156,07, í sömu röð.Eftirfarandi krosstengingarhvarfsstaðir eru teknir til greina: KK, KS og KN-TERM, án skýrslujóna.Bæði forefni og brot ppm voru stillt á 20 og Xrea þröskuldurinn var stilltur á 0,15.Trypsín var talið vera algjörlega sérstakt og háorku C-gildra (HCD) sundrunaraðferð var innleidd.XCorr dynamic DB minnkun þröskuldur og lágmarksfjöldi peptíða fyrir dynamic DB minnkun voru stillt á 2,5 og 2, í sömu röð.Aðrar breytur eru: einsamsætulíkur og hámarkssamsvörunarmörk, lágmark 4 AA leifar á hvern streng og hámarks strenghleðslu, og 3 hámark af misstum klofningum.Saumuðu tvívíddarkortin sem fengust voru greind í (SIM-XL) og xQuest28 myndræn framsetning var notuð til að búa til tvívíddarkortin.Prótein krosstengingar á próteinbyggingum eru veittar í PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, útgáfa 2.0 Schrödinger, LLC).
Prótein líkanbyggingar voru búnar til með því að nota Phyre2 netþjóninn (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 með því að nota meginreglur samkynhneigðrar líkana og útfærslu á „Hidden Markov Method“.Phyre2 býr til líkanbyggingar byggðar á röðun við þekkta próteinbyggingu.Fyrir H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 og MDN1 prótein voru sniðmátbyggingar 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 og 6i2665 notuð.Að auki var einnig litið til uppbyggingar AlphaFold71 MX1, UBP18 og ROBO1.Próteinbyggingin var sýnd með því að nota BIOVIA Discovery Studio Visualizer pakkann (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, Bandaríkjunum) og Molecular Operating Environment pakkann (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).