347 12,7 * 1,24 mm Ryðfrítt stál vafningsrör, sameindabúnaður samstilltur rafstöðueiginleikar og samtenging α-synuclein og tau

Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Þú ert að nota vafraútgáfu með takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Að auki, til að tryggja áframhaldandi stuðning, sýnum við síðuna án stíla og JavaScript.
Rennistikur sem sýna þrjár greinar á hverri glæru.Notaðu til baka og næsta hnappa til að fara í gegnum glærurnar, eða rennibrautarhnappana í lokin til að fara í gegnum hverja glæru.

347 Ryðfrítt stálrör

347 12,7*1,24mm Ryðfrítt stál vafningsrör

Ytri þvermál: 6,00 mm OD allt að 914,4 mm OD, Stærðir allt að 24” NB fáanleg á lager, OD stærð Stálrör fáanleg á lager

SS 347 Pípuþykktarsvið: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, osfrv. (0,5-12mm) Eða óvenjuleg stærð til að sníða eftir þörfum

Gerð: SS 347 Óaðfinnanlegur rör |SS 347 ERW rör |SS 347 soðin rör |SS 347 tilbúnar rör |SS 347 CDW rör, LSAW rör / saumsoðin / endurteiknuð

Form: SS 347 kringlótt rör/rör, SS 347 ferningur/rör, SS 347 rétthyrnd rör/rör, SS 347 spólurör, SS 347 „U“ lögun, SS 347 pönnukökuspólur, SS 347 vökvarör

Lengd: Einn tilviljunarkenndur, tvöfaldur tilviljunarkenndur og áskilin lengd endi: Einfaldur endi, skástur endi, troðinn

Endavörn: Plasthettur |Ytri frágangur: 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Finish fyrir ryðfríu stáli rör, klára samkvæmt kröfum viðskiptavina

Afhendingarástand: Grænt og súrsætt, slípað, bjart glóðað, kalt dregið

Skoðun, prófunarskýrslur: Mill prófunarvottorð, EN 10204 3.1, efnaskýrslur, vélrænar skýrslur, PMI prófunarskýrslur, sjónræn skoðunarskýrslur, skoðunarskýrslur þriðja aðila, NABL samþykktar rannsóknarskýrslur, eyðileggjandi prófunarskýrslur, ekki eyðileggjandi prófunarskýrslur

Pökkun: Pakkað í trékassa, plastpoka, stálræmur í búnt eða samkvæmt beiðni viðskiptavina

Sérstök: Hægt er að framleiða aðrar stærðir og upplýsingar en hér að ofan sé þess óskað

SS 347 pípustærðarsvið: 1/2 tommur NB, OD til 24 tommur

ASTM A312 347: Óaðfinnanleg og beinsaumssoðin austenítísk pípa ætlað fyrir háhita og almenna ætandi þjónustu.Fyllimálmur ekki leyfður við suðu.

ASTM A358 347: Rafmagnsbræðslusoðið austenítísk pípa fyrir ætandi og/eða háhitaþjónustu.Venjulega er aðeins pípa allt að 8 tommur framleidd samkvæmt þessari forskrift.Heimilt er að bæta við fyllimálmi við suðu.

ASTM A790 347: Óaðfinnanleg og beinsaumssoðin ferrític/austenitic (tvíhliða) pípa ætlað fyrir almenna ætandi þjónustu, með sérstakri áherslu á viðnám gegn tæringarsprungum.

ASTM A409 347: Rafmagnsbræðslusoðið með beinsaumum eða spíralsaumum, austenítískt ljósveggspípa með stórum þvermál í stærðum 14" til 30" með veggjum Sch5S og Sch 10S fyrir ætandi og/eða háa

ASTM A376 347: Óaðfinnanlegur austenítísk pípa fyrir háhitanotkun.

ASTM A813 347: Einsaums, ein- eða tvísoðið austenítísk pípa fyrir háhita og almenna ætandi notkun.

ASTM A814 347: Kalt unnið soðið austenítískt rör fyrir háhita og almenna ætandi þjónustu.

347H ryðfríu stáli rör efnasamsetning

Vélrænir eiginleikar ryðfríu stáli 347H rör

Ryðfrítt stál 347H rör Eðlisfræðilegir eiginleikar

Samsvarandi einkunnir fyrir 347H ryðfrítt stálrör

Amyloid alfa-synuclein (αS) samloðun er einkenni Parkinsonsveiki og annarra synucleinopathy.Nýlega hefur tau próteinið sem almennt er tengt við Alzheimerssjúkdóm verið tengt αS meinafræði og fundist það samstaða í αS-ríkum innfellingum, þó að sameindaháttur samtengingar próteinanna tveggja sé enn óljós.Við greinum frá því hér að αS fasinn aðskilur í fljótandi þéttingu með rafstöðueiginleikum flóknum þéttingu með jákvætt hlaðnum fjölpeptíðum eins og tau.Það fer eftir sækni αS í pólýkatjónir og hraða gildisþurrðar á storkunetinu, blóðtappa gangast undir hraðri hlaupmyndun eða samruna fylgt eftir með hægum amyloid samloðun.Með því að sameina úrval af háþróaðri lífeðlisfræðilegri tækni tókst okkur að einkenna vökva-vökva αS/Tau fasaaðskilnaðinn og bera kennsl á lykilþættina sem leiða til myndunar misleitra efna sem innihalda bæði próteinin í fljótandi próteinþétti.
Til viðbótar við himnuhólf er einnig hægt að ná staðbundnum aðskilnaði í frumum með myndun próteinaríkra, vökvalíkra þéttra líkama sem kallast lífsameindaþéttir eða dropar, með ferli sem kallast vökva-vökvafasaskilnaður (LLPS).Þessir dropar myndast með marggildum tímabundnum víxlverkunum, venjulega milli próteina eða próteina og RNA, og þjóna margvíslegum aðgerðum í næstum öllum lífkerfum.Mikill fjöldi LLP-hæfra próteina sýnir raðir af litlum flóknum hætti sem eru mjög truflaðar í eðli sínu og við myndun lífsameindaþétta3,4,5.Fjölmargar tilraunarannsóknir hafa leitt í ljós sveigjanlegt, oft röskunlegt og fjölgildt eðli próteina sem mynda þessar vökvalíku þéttingar, þó lítið sé vitað um sértæka sameindaákvarðanir sem stjórna vexti og þroska þessara þéttiefna í fastari efni. ríki..
Nýju gögnin styðja þá tilgátu að afbrigðilegt próteindrifið LLPS og umbreyting dropa í fastar byggingar geti verið viðeigandi frumuleiðir sem leiða til myndunar óleysanlegra eitraðra efna sem oft eru einkenni hrörnunarsjúkdóma.Mörg LLPS-tengd innri röskuð prótein (IDP), oft mjög hlaðin og sveigjanleg, hafa lengi verið tengd taugahrörnun í gegnum ferli amyloid samloðun.Sérstaklega hefur verið sýnt fram á að lífsameinda IDP-þéttingar eins og FUS7 eða TDP-438 eða prótein með stór lén með lágum flóknum hætti eins og hnRNPA19 eldast í hlauplík eða jafnvel fast form með ferli sem kallast vökvamyndun.efnasamband.yfir í fastfasaskipti (LSPT) sem fall af tíma eða sem svar við ákveðnum breytingum eftir þýðingu eða sjúklega mikilvægum stökkbreytingum1,7.
Annar IDP sem tengist LLPS in vivo er Tau, örpíplutengd truflun prótein þar sem amyloid samloðun hefur verið bendluð við Alzheimerssjúkdóm10 en hefur einnig nýlega verið bendluð við Parkinsonsveiki (PD) og önnur taugamótakjarnapróteinprótein 11, 12, 13 tengjast.Sýnt hefur verið fram á að Tau losnar af sjálfu sér frá lausn/frumvökva vegna hagstæðra rafstöðueiginleika milliverkana14, sem leiðir til myndunar tau-auðgaðra dropa sem kallast rafstöðueiginleikar.Einnig hefur komið fram að þessi tegund af ósértækum samskiptum er drifkrafturinn á bak við mörg lífsameindaþéttiefni í náttúrunni15.Þegar um tau prótein er að ræða getur rafstöðueiginleiki myndast með einfaldri samloðun, þar sem öfugt hlaðin svæði próteinsins koma af stað klofningsferlinu, eða með flókinni samloðun með samspili við neikvætt hlaðnar fjölliður eins og RNA.
Nýlega hefur verið sýnt fram á α-synuclein (αS), amyloid IDP sem tengist PD og öðrum taugahrörnunarsjúkdómum, sameiginlega þekktir sem synucleinopathy17,18, í frumu- og dýralíkönum19,20 sem eru einbeitt í próteinþétti með vökvalíkri hegðun.In vitro rannsóknir hafa sýnt að αS gangast undir LLPS með einfaldri samloðun í gegnum aðallega vatnsfælin milliverkanir, þó að þetta ferli krefjist einstaklega hás próteinstyrks og óvenjulega langan ræktunartíma19,21.Hvort þéttiefni sem innihalda αS sem sést í lífi myndast af þessu eða öðrum LLPS ferlum er enn lykilatriði óleyst.Að sama skapi, þó að αS amyloid samloðun hafi sést í taugafrumum í PD og öðrum synucleinopathies, er nákvæmlega hvernig αS gangast undir amyloid samruna innanfrumu óljóst, þar sem oftjáning þessa próteins virðist ekki koma af stað þessu ferli af sjálfu sér.Oft er þörf á frekari frumuskemmdum, sem bendir til þess að ákveðnar frumustaðsetningar eða örumhverfi séu nauðsynlegar til að endurnýja αS amyloid samsetningar innanfrumu.Eitt frumuumhverfi sem er sérstaklega viðkvæmt fyrir samloðun getur verið innra hluta próteinþéttinga 23 .
Athyglisvert hefur verið sýnt fram á að αS og tau eru staðbundin í einkennandi sjúkdómsinnihaldi hjá mönnum með Parkinsonsveiki og aðra synucleinopathy 24,25 og tilraunir hafa greint frá samverkandi meinafræðilegu sambandi milli próteinanna tveggja 26,27 sem bendir til hugsanlegs sambands milli samloðun αS og tau í taugahrörnunarsjúkdómum.veikindi.αS og tau hafa reynst hafa víxlverkun og stuðla að söfnun hvors annars in vitro og in vivo 28,29 og misleitar einingar úr þessum tveimur próteinum hafa sést í heila sjúklinga með synucleinopathy 30 .Hins vegar er lítið vitað um sameindagrundvöll víxlverkunarinnar milli αS og tau og verkunarháttinn við samsöfnun þess.Tilkynnt hefur verið um að αS hafi samskipti við tau í gegnum rafstöðueiginleika aðdráttarafls milli mjög neikvætt hlaðna C-enda svæði αS og miðlæga prólínríka svæði tau, sem einnig er auðgað af jákvætt hlaðnum leifum.
Í þessari rannsókn sýnum við að αS getur örugglega sundrast í dropa með rafstöðueiginleikum flóknum þéttingu í viðurvist tau próteins, öfugt við samskipti þess við önnur jákvætt hlaðin fjölpeptíð eins og pólý-L-lýsín (pLK), og í þessu ferli.αS virkar sem vinnupalla sameind fyrir dropanetið.Við höfum greint merkjanlegan mun á þroskaferli rafstöðueiginleika αS coacervats, sem tengjast mismun á gildi og styrkleika samspils próteina sem taka þátt í coacervate netinu.Athyglisvert var að við sáum samsamruna αS og tau amyloid próteina í langlífum vökva coacervötum og auðkenndum nokkra lykilþætti sem leiða til sameiningar þessara tveggja próteina í slíkum coacervötum.Hér lýsum við í smáatriðum þessu ferli, sem er mögulegur sameindabúnaður sem liggur að baki sambyggðu tveggja próteina í sjúkdómssértækum innfellingum.
αS hefur mjög anjónískan C-enda hala við hlutlaust pH (mynd 1a), og við gerðum tilgátu um að það gæti gengist undir LLPS með þéttingu rafstöðueiginleika fléttna með fjölkatjónískum röskuðum fjölpeptíðsameindum.Við notuðum 100 leifar pólý-L-lýsín (pLK) sem upphafslíkan sameind vegna jákvætt hlaðinnar og óreglulegrar fjölliða eðlis við hlutlaust pH 32. Í fyrsta lagi staðfestum við að pLK hefur samskipti við Ct lén αS með lausn NMR litrófsgreiningu (Mynd 1b) með því að nota 13C/15N-merkt αS í nærveru vaxandi αS:pLK mólhlutfalla.Samspil pLK við Ct-lén αS kemur fram í truflunum á efnabreytingunni og lækkun á hámarksstyrk á þessu svæði próteinsins.Athyglisvert er að þegar við blönduðum αS við pLK í αS styrk upp á u.þ.b.5–25 µM í nærveru pólýetýlen glýkóls (5–15% PEG-8) (dæmigert LLPS biðminni: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) fórum við strax í gegnum breitt svið próteinmyndunar .dropar sáust með því að nota flúrljómun (WF) og bjarta sviði (BF) smásjá (mynd 1c).1-5 µm dropar sem innihalda einbeitt αS (bætt við 1 µM AlexaFluor488-merktu αS, AF488-αS), rafstöðueiginleikar þeirra má fá út frá viðnám þeirra gegn 10% 1,6-hexandiol (1,6-HD) og næmi þess fyrir aukning á styrk NaCl (mynd 1c).The vökva-eins eðli coacervates af αS / pLK rafstöðueiginleika flókið er sýnt fram á getu þeirra til að smelt innan millisekúndna (Mynd 1d).Með því að nota gruggmæling, töluðum við myndun dropa við þessar aðstæður, staðfestum rafstöðueiginleika helstu samspils sem tengist stöðugleika þess (mynd 1e) og metum áhrif ýmissa fjölliðahlutfalla á LLPS ferli (mynd 1f).Þrátt fyrir að dropamyndun komi fram á breitt svið fjölliðahlutfalla er ferlið mjög hagstætt þegar pLK er umfram αS.LLPs hafa einnig sést með því að nota efnafræðilega mismunandi tilfærslumiðilinn dextran-70 (70 kDa) eða með því að nota margs konar sýnishorn, þar á meðal glerglasdropa, örplötuholur úr ýmsum efnum, Eppendorf- eða kvarsháræð.
skýringarmynd af mismunandi prótínsvæðum í WT-αS og ΔCt-αS afbrigðum sem notuð eru í þessari rannsókn.Amphipathic N-terminal lénið, vatnsfælna amyloid-myndandi (NAC) svæðið og neikvætt hlaðna C-enda lénið eru sýnd í bláu, appelsínugulu og rauðu, í sömu röð.Nettógjald á afgangskort (NCPR) af WT-αS er sýnt.b NMR greining á αS/pLK víxlverkuninni í fjarveru stórsameindaklumpa.Þegar styrkur pLK eykst (aS:pLK mólhlutföll 1:0,5, 1:1,5 og 1:10 eru sýnd í ljósgrænu, grænu og dökkgrænu, í sömu röð).c Coacervate αS/pLK (mólhlutfall 1:10) við 25 µM (1 µM AF488-merkt αS eða Atto647N-merkt pLK fyrir WF myndatöku) í LLPS jafnalausn (efst) eða bætt við 500 mM NaCl (neðst til vinstri) eða eftir 10 % 1,6-hexandiól (1,6-HD; neðst til hægri).Skalastrik = 20 µm.d Fulltrúar smásjármyndir af BF dropasamruna αS/pLK (mólhlutfall 1:10) í styrkleika 25 μM;örvar gefa til kynna samruna einstakra dropa (rauðra og gulra örva) í nýjan dropa (appelsínugul ör) innan 200 ms).Skalastrik = 20 µm.e Ljósdreifandi (við 350 nm) αS/pLK samsöfnun í LLPS biðminni fyrir og eftir að 500 mM NaCl eða 10% 1,6-HD er bætt við við 25 µM αS (N = 3 sýnisendurtekningar, meðaltal og staðalfrávik einnig gefið til kynna).f BF mynd (efst) og ljósdreifingargreining (við 350 nm, neðst) á αS/pLK samloðun við 25 μM αS með vaxandi αS:pLK mólhlutfalli (N = 3 sýnisendurtekningar, meðaltal og staðalfrávik einnig gefið til kynna).Skalastrik = 10 µm.Kvarðarstikan á einni mynd sýnir mælikvarða allra mynda á einu spjaldi.Hrágögn eru veitt í formi hrágagnaskráa.
Byggt á athugunum okkar á αS/pLK rafstöðueiginleikaþéttingu og fyrri athugunum á αS sem skjólstæðingssameind tau/RNA þéttiefnisins í gegnum beina víxlverkun við tau31, gerðum við tilgátu um að αS og tau gætu aðskilið sig með leysinum í fjarveru RNA. þétting.í gegnum rafstöðueiginleikafléttur, og αS er vinnupallinn í αS/Tau coacervate (sjá tau hleðsludreifingu á mynd 2e).Við sáum að þegar 10 μM αS og 10 μM Tau441 (inniheldur 1 μM AF488-αS og 1 μM Atto647N-Tau, í sömu röð) var blandað saman í LLPS jafnalausn, mynduðu þeir auðveldlega próteinsamstæður sem innihéldu bæði prótein, eins og sést með WF smásjá.(Mynd 2a).Samstaða próteinanna tveggja í dropunum var staðfest með confocal (CF) smásjá (aukamynd 1a).Svipuð hegðun kom fram þegar dextran-70 var notað sem samloðunarefni (viðbótarmynd 1c).Með því að nota annaðhvort FITC-merkt PEG eða dextran, komumst við að því að báðir ruðningsefnin dreifðust jafnt yfir sýnin og sýndu hvorki aðskilnað né tengsl (viðbótarmynd 1d).Frekar bendir það til þess að í þessu kerfi stuðli þeir að fasaaðskilnaði með stórsameindafjölgunaráhrifum, þar sem PEG er helst stöðugt ruðningsefni, eins og sést í öðrum LLP kerfum33,34.Þessir próteinríku dropar voru viðkvæmir fyrir NaCl (1 M) en ekki fyrir 1,6-HD (10% v/v), sem staðfestir rafstöðueiginleika þeirra (aukamynd 2a, b).Vökvahegðun þeirra var staðfest með því að fylgjast með millisekúndna samruna dropatilvika með BF smásjá (mynd 2b).
a Confocal (CF) smásjármyndir af αS/Tau441 coacervates í LLPS buffer (10 μM af hverju próteini, 0,5 μM af AF488-merktu αS og Atto647N-merktu Tau441).b Representative differential interference contrast (DIC) myndir af αS/Tau441 dropasamrunatilvikum (10 μM fyrir hvert prótein).c Áfangamynd byggð á ljósdreifingu (við 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) í fjarveru (vinstri) eða viðveru (hægri) 50 µM αS.Hlýri litir gefa til kynna meiri dreifingu.d Ljósdreifing αS/Tau441 LLPS sýna með vaxandi αS styrk (Tau441 við 5 µM, N = 2–3 endurtekningar sýna eins og gefið er til kynna).e Skýringarmynd af sumum tau próteinafbrigðum og mismunandi svæðum próteinsins sem notuð eru í þessari rannsókn: neikvætt hlaðið N-endasvæði (rautt), prólínríkt svæði (blátt), örpíplabindandi svæði (MTBD, auðkennt með appelsínugult) og amyloid-myndandi par spírall.filament svæði (PHF) staðsett innan MTBD (grá).Nettógjald á hverja leifar (NCPR) kortið af Tau441 er sýnt.f Notkun 1 µM AF488-merkt αS og Atto647N-merkt ΔNt-, með því að nota 1 µM AF488-merkt αS eða ΔCt-αS í nærveru ΔNt-Tau (efst, 10 µM á prótein) eða K150 prótein (neðst) ) ) ) smámyndir af WF þéttað í LLPS eða K18 biðminni.Kvarðastikurnar á einni mynd tákna mælikvarða allra mynda í einu spjaldi (20 µm fyrir spjald a, b og f).Hrágögn fyrir spjaldið c og d eru afhent sem hrágagnaskrár.
Til að prófa hlutverk αS í þessu LLPS ferli, rannsökuðum við fyrst áhrif αS á stöðugleika dropa með nýrnamælingum með því að nota aukinn styrk NaCl (mynd 2c).Því hærri sem saltstyrkurinn er í sýnunum sem innihalda αS, því hærra eru ljósdreifingargildin (við 350 nm), sem gefur til kynna stöðugleikahlutverk αS í þessu LLPS kerfi.Svipuð áhrif má sjá með því að auka αS styrk (og þar af leiðandi αS:Tau441 hlutfallið) í u.þ.b.10-föld aukning miðað við styrk tau (5 µM) (mynd 2d).Til að sýna fram á að αS er vinnupalla prótein í coacervates, ákváðum við að kanna hegðun LLPS-truflaða Tau stökkbrigðisins, sem skortir neikvætt hlaðið N-enda svæði (leifar 1-150, sjá mynd 2e) sem kallast ΔNt-Tau.WF smásjárskoðun og nýrnamælingar staðfestu að ΔNt-Tau sjálft gekkst ekki undir LLPS (mynd 2f og viðbótarmynd 2d), eins og áður hefur verið greint frá 14. Hins vegar, þegar αS var bætt við dreifilausnir af þessu stytta Tau afbrigði, var LLPS ferlið algjörlega endurheimt með dropaþéttleika nálægt dropaþéttleika Tau og αS lausna í fullri stærð við svipaðar aðstæður og próteinstyrk.Þetta ferli er einnig hægt að fylgjast með við aðstæður með lítilli stórsameindafjölgun (aukamynd. 2c).Sýnt var fram á hlutverk C-enda αS svæðisins, en ekki allrar lengdar þess, í LLPS ferlinu með því að hindra dropamyndun með því að nota C-enda stytt αS afbrigði sem vantar leifar 104-140 (mynd 1a) af (ΔCt- αS) prótein (mynd 2f og aukamynd 2d).Colocalization αS og ΔNt-Tau var staðfest með confocal flúrljómun smásjá (aukamynd. 1b).
Til að prófa LLPS vélbúnaðinn frekar á milli Tau441 og αS var notað Tau afbrigði til viðbótar, þ.e. pöruð helical filament core (PHF) brot í örpíplabindandi léninu (MTBD), sem ef það inniheldur fjögur einkennandi endurtekningarlén, sem er almennt þekkt sem K18 brotið (sjá mynd 2e).Nýlega hefur verið greint frá því að αS binst helst tau próteini sem er staðsett í prólínríku léni í röð sem er á undan örpíplabindandi léninu.Hins vegar er PHF svæðið einnig ríkt af jákvætt hlaðnum leifum (sjá mynd 2e), sérstaklega lýsíni (15% leifar), sem varð til þess að við prófuðum hvort þetta svæði stuðli einnig að þéttingu αS/Tau flóksins.Við sáum að K18 eitt og sér gæti ekki kallað fram LLPS við styrk allt að 100 μM við þær aðstæður sem prófuð voru (LLPS biðminni með 15% PEG eða 20% dextrani) (Mynd 2f).Hins vegar, þegar við bættum 50 µM αS við 50 µM K18, kom fram hröð myndun próteindropa sem innihéldu K18 og αS með nýrnamælingum (viðbótarmynd 2d) og WF smásjá (Mynd 2f).Eins og búist var við, gat ΔCt-αS ekki endurheimt LLPS hegðun K18 (mynd 2f).Við athugum að αS/K18 samsöfnun þarf aðeins hærri próteinstyrk til að framkalla LLPS samanborið við αS/ΔNt-Tau eða αS/Tau441, að öðru óbreyttu.Þetta er í samræmi við sterkari víxlverkun αS C-enda svæðisins við prólínríka Tau lénið samanborið við örpíplabindandi lénið, eins og áður hefur verið lýst 31 .
Í ljósi þess að ΔNt-Tau getur ekki framkvæmt LLPS í fjarveru αS, völdum við þetta Tau afbrigði sem fyrirmynd til að einkenna αS/Tau LLPS í ljósi einfaldleika þess í LLPS kerfum með Tau í fullri lengd (samsæta, Tau441/Tau441).með flóknum (heterotypic, αS/Tau441) samsöfnunarferlum.Við bárum saman stig αS samloðunar (sem hluti af þétta fasaprótíninu, fαS,c) í αS/Tau og αS/ΔNt-Tau kerfunum með skilvindu og dreifðum fasa SDS-PAGE greiningu (sjá 2e), fundum mjög svipuð gildi fyrir öll prótein í sama styrk.Sérstaklega fengum við fαS,c 84 ± 2% og 79 ± 7% fyrir αS/Tau og αS/ΔNt-Tau, í sömu röð, sem bendir til þess að gagngerð víxlverkun milli αS og tau sé betri en víxlverkun tau sameinda.á milli.
Samspil við ýmsar pólýkatjónir og áhrif þéttingarferlisins á αS-hvörf voru fyrst rannsökuð með flúrljómunarbata eftir ljósbleikju (FRAP) aðferð.Við prófuðum αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau og αS/pLK coacervate (100 μM αS bætt við 2 μM αS AF488-αS og 100 μM Tau441 eða ΔNt-Tau eða 1 mM pLK).Gögn fengust á fyrstu 30 mínútunum eftir að sýnishlutunum var blandað saman.Af dæmigerðum FRAP myndum (mynd 3a, αS/Tau441 þétting) og samsvarandi tímaferlisferlum þeirra (mynd 3b, viðbótarmynd 3), má sjá að αS hreyfihvörf eru mjög svipuð og Tau441 coacervata.og ΔNt-Tau, sem er miklu hraðari með pLK.Útreiknaðir dreifingarstuðlar fyrir αS inni í coacervate samkvæmt FRAP (eins og lýst er af Kang o.fl. 35) eru D = 0,013 ± 0,009 µm2/s og D = 0,026 ± 0,008 µm2/s fyrir αS/TauS/441 og αN tauS/Δ αS/ kerfið.pLK, Tau og D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, í sömu röð (Mynd 3c).Hins vegar er dreifingarstuðullinn αS í dreifða fasanum nokkrum stærðargráðum hærri en allir þéttir fasar, eins og ákvarðað er með flúrljómunarfylgni litrófsgreiningu (FCS, sjá viðbótarmynd 3) við sömu aðstæður (LLPS biðminni) en án fjölkatjóna. (D = 8 ± 4 µm2/s).Þess vegna minnkar hreyfihvörf αS þýðinga verulega í coacervate samanborið við prótein í dreifða fasanum vegna áberandi sameindaþrengslna, þó að öll coacervat haldi vökvalíkum eiginleikum fyrsta hálftímann eftir myndun þeirra, öfugt við tau fasann.hraðari hreyfifræði í pLK þéttivatni.
a–c FRAP greining á αS gangverki (2% AF488-merkt αS) í rafstöðueiginleikum.Sýndar myndir af αS/Tau441 FRAP prófum í þríriti eru sýndar í (a), þar sem rauðir hringir gefa til kynna aflituð svæði.Kvarðastöngin er 5 µm.b Meðaltals FRAP ferlar og (c) reiknaðir útbreiðslustuðlar (D) fyrir 5–6 (N) mismunandi dropa úr þremur tilraunum með 100 µM αS og jafnmólstyrk Tau441 (rautt) eða ΔNt-Tau (blátt) eða pLK (grænt) við tífaldan styrk LLPS.Staðalfrávik FRAP ferilsins er sýnt í skyggðum lit.Til samanburðar var dreifingarstuðullinn αS í dreifða fasanum ákvarðaður í þríriti með því að nota flúrljómunarfylgni litrófsgreiningu (FCS) (sjá viðbótarmynd 3 og aðferðir fyrir frekari upplýsingar).d Stöðugt X-band EPR litróf 100 μM TEMPOL-122-αS í LLPS jafnalausn án nokkurrar pólýkatjónar (svart) eða í viðurvist 100 μM Tau441 (rautt) eða ΔNt-Tau (blátt) eða 1 mM pLK (grænt).Innfellingin sýnir stækkað útsýni yfir sterku sviðslínurnar þar sem mestu breytingarnar eiga sér stað.e Bindunarferlar 50 μM TEMPOL-122-αS með ýmsum fjölkatjónum í fjarveru LLPS (engin PEG).Minnkað amplitude band III samanborið við band II (IIII/III) á eðlilegu EPR litrófinu er sýnt fram á að auka mólhlutföllin Tau441 (rautt), ΔNt-Tau (blátt) og pLK (grænt).Litaðar línur sýna passa við gögn með því að nota gróft bindilíkan með n eins og óháðum bindistaði á hverri feril.Hrágögn eru veitt í formi hrágagnaskráa.
Sem viðbót könnuðum við gangverki αS í ýmsum coacervate með því að nota stýrða snúningsmerkingu (SDSL) og samfellda rafsegulómun (CW-EPR).Þessi aðferð hefur reynst mjög gagnleg til að tilkynna sveigjanleika og gangverki IDP með raunhæfri afgangsupplausn36,37,38.Í þessu skyni smíðuðum við cysteinleifar í stökum Cys stökkbreyttum og notuðum 4-hýdroxý-2,2,6,6-tetrametýlpíperidín-N-oxýl (TEMPOL) snúningsnemann.Maleimíð afleiður merkja þær.Nánar tiltekið settum við inn TEMPOL rannsaka í stöðu 122 eða 24 αS (TEMPOL-122-αS og TEMPOL-24-αS).Í fyrra tilvikinu miðum við á C-enda svæði próteinsins, sem tekur þátt í samskiptum við fjölkatjónir.Í staðinn getur staða 24 gefið okkur upplýsingar um heildarvirkni próteina í þéttivatninu.Í báðum tilfellum samsvaraði EPR merkin sem fengust fyrir prótein í dreifða fasanum til nítroxíðefna í hraðvirku ástandi.Eftir fasaaðskilnað í nærveru tau eða pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 eða ΔNt-Tau í hlutfallinu 1:1 eða pLK í hlutfallinu 1:10) kom fram aukning á hlutfallslegum hámarksstyrk í EPR litróf αS.Tapslínan stækkaði, sem gefur til kynna minnkaða αS endurstefnuhreyfingu í dropum samanborið við prótein í þynntum fasa (mynd 3d, viðbótarmynd 4a).Þessar breytingar eru meira áberandi í stöðu 122. Þó að í stöðu 24 hafi tilvist pLK ekki haft áhrif á hreyfihvörf rannsakandans, í stöðu 122 breyttist litrófslínan verulega (aukamynd 4a).Þegar við reyndum að móta litrófið í stöðu 122 í tveimur αS/fjölkynjakerfum með því að nota samsætulíkanið (viðbótarmynd 5a) sem almennt er notað til að lýsa gangverki spunamerkts IDP38,39, gátum við ekki endurbyggt tilraunarrófið..Litrófslíking af stöðu 24 snúninga andstæðum (aukamynd. 5a).Þetta bendir til þess að það séu ívilnandi stöður í rými snúningsstillinga á C-endasvæði αS í viðurvist fjölkatjóna.Þegar tekið er tillit til hluta αS í þétta fasanum við tilraunaaðstæður EPR (84 ± 2%, 79 ± 7% og 47 ± 4% fyrir αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, og αS/pLK, í sömu röð – sjá viðbótarupplýsingar Mynd 2e af gagnagreiningu c), má sjá að breikkunin sem greind er með EPR aðferðinni endurspeglar aðallega samspil C-enda svæðis αS við ýmsar pólýkatjónir í þéttum fasa (helsta breytingin við notkun TEMPOL-122- αS), en ekki próteinþétting.Aukning á örseigju sést í rannsakanum.Eins og búist var við var EPR litróf próteinsins við aðrar aðstæður en LLPS algjörlega endurheimt þegar 1 M NaCl var bætt við blönduna (aukamynd. 4b).Á heildina litið benda gögn okkar til þess að breytingarnar sem greinast með CW-EPR endurspegli aðallega víxlverkun C-enda svæðis αS við ýmsar pólýkatjónir í þétta fasanum og þessi víxlverkun virðist vera sterkari með pLK en við Tau.
Til þess að fá frekari upplýsingar um uppbyggingu próteinanna í coacervatinu ákváðum við að rannsaka LLPS kerfið með því að nota NMR í lausn.Hins vegar gátum við aðeins greint αS brotið sem er eftir í dreifða fasanum, sem gæti stafað af minni próteinvirkni inni í coacervatinu og þéttum fasa neðst í lausninni í NMR greiningu.Þegar við greindum uppbyggingu og gangverki próteinsins sem er eftir í dreifða fasa LLPS sýnisins með því að nota NMR (viðbótarmynd. 5c, d), tókum við eftir því að próteinið hegðaði sér nánast eins í viðurvist pLK og ΔNt-Tau, bæði af sem voru í efri byggingu og gangverki próteinhryggjarins, sem komu í ljós með tilraunum á efri efnabreytingum og R1ρ slökun.NMR gögn sýna að C-enda αS verður fyrir verulegu tapi á sveigjanleika í sköpum á meðan hann heldur röskuðu eðli sínu, eins og restin af próteinröðinni, vegna víxlverkana þess við fjölkatjónir.
Þar sem breikkun CW-EPR merkja sem sést í TEMPOL-122-αS þétta fasanum endurspeglar víxlverkun próteinsins við fjölkatjónir, gerðum við EPR títrun til að meta bindisækni αS við ýmsar fjölkatjónir í fjarveru LLPS (engin uppsöfnun Buffer LLPS), sem bendir til þess að milliverkanirnar séu þær sömu í þynntum og þéttum fasum (sem er staðfest af gögnum okkar, viðbótarmynd 4a og viðbótarmynd 6).Markmiðið var að sjá hvort öll coacervat, þrátt fyrir sameiginlega vökvalíka eiginleika þeirra, sýna einhverja undirliggjandi mismunahegðun á sameindastigi.Eins og búist var við stækkaði EPR litrófið með aukinni styrk fjölkatjóna, sem endurspeglar minnkun á sameindasveigjanleika vegna sameindasamskipta allra samskiptafélaga næstum því að metta (mynd 3e, viðbótarmynd 6).pLK náði þessari mettun í lægra mólhlutfalli (fjölkatjón:αS) samanborið við ΔNt-Tau og Tau441.Reyndar sýndi samanburður á gögnunum við áætluð bindingarlíkan sem gerir ráð fyrir n eins og óháðum bindistaði að sýnilegur sundrunarfasti pLK (~5 μM) er stærðargráðu lægri en Tau441 eða ΔNt-Tau (~50 μM) ).µM).Þó að þetta sé gróft mat bendir þetta til þess að αS hafi meiri sækni í einfaldari fjölkatjónir með samfellda jákvæða hleðslusvæði.Í ljósi þessa munar á sækni milli αS og ýmissa fjölkatjóna, gerðum við tilgátu um að vökvaeiginleikar þeirra gætu breyst á annan hátt með tímanum og þjáðist því af mismunandi LSPT ferlum.
Í ljósi þess að umhverfið er mjög fjölmennt innan prótein coacervatsins og amyloid eðli próteins, fylgdumst við með hegðun coacervatsins með tímanum til að greina hugsanlega LSPT ferla.Með því að nota BF og CF smásjárskoðun (Mynd 4) sáum við að αS/Tau441 sameinast að miklu leyti í lausn og mynda stóra dropa sem snerta og bleyta yfirborðið neðst á brunninum/rennunni sem fullir dropar, eins og búist var við (aukamynd .7d);við köllum þessa botnmynduðu mannvirki „próteinfleka“.Þessi mannvirki héldust fljótandi þar sem þau héldu getu til að sameinast (viðbótarmynd 7b) og sást í nokkrar klukkustundir eftir að LLPS var ræst (mynd 4 og viðbótarmynd 7c).Við tókum eftir því að bleytingarferlið er ákjósanlegt á yfirborði vatnssækinna frekar en vatnsfælna efna (aukamynd 7a), eins og búist er við fyrir rafstöðueiginleikar með ójafnvægi hleðslu og þar með mikla rafstöðueiginleika yfirborðsgetu.Athyglisvert var að αS/ΔNt-Tau samruni og rafting minnkaði verulega, en αS/pLK þéttiefni minnkaði verulega (mynd 4).Á stuttum ræktunartímanum gátu αS/pLK droparnir runnið saman og bleyta vatnssækna yfirborðið, en þetta ferli hætti fljótt og eftir 5 klst ræktun sáust aðeins takmarkaðir samrunatilvik og engin bleyta.– hlaup-dropa umskipti.
Fulltrúi BF (gráskala spjaldið) og CF (hægri spjaldið, AF488-merkt αS í grænu) af coacervate sýnum sem innihalda 100 µM αS (1% flúrljómandi merki) í LLPS biðminni í viðurvist 100 µM Tau441 (efst) flúrljómunarmynda ΔN. -Tau (miðja) eða 1 mM pLK (neðst) við mismunandi ræktunartíma og brennivídd (z, fjarlægð frá botni plötubrunns).Tilraunirnar voru endurteknar 4-6 sinnum óháð hver annarri með sömu niðurstöðum.αS/Tau441 coacervates eru blautir eftir 24 klukkustundir og mynda fleka stærri en myndin.Kvarðarstikan fyrir allar myndir er 20 µm.
Við spurðum síðan hvort stóru vökvalíku próteinsafnin sem myndast í αS/Tau441 LLPS myndu leiða til amyloid samloðun einhvers af próteinum sem rannsakað var.Við fylgdumst með þroska αS/Tau441 dropa með tímanum með WF smásjá við sömu aðstæður og hér að ofan, en með því að nota 1 μM AF488-merkt αS og Atto647N-merkt Tau441 (mynd 5a).Eins og við var að búast sáum við fullkomna próteinstaðsetningu í gegnum þroskaferlið.Athyglisvert er að frá ca.Eftir 5 klukkustundir sáust ákafari óhringlaga mannvirki inni í flekunum, sem við kölluðum „punkta“, sumir hverjir voru sambyggðir með αS og sumir voru auðgaðir í Tau441 (mynd 5a, hvítar örvar).Þessir blettir hafa alltaf sést innan fleka í meira mæli fyrir αS/ΔNt-Tau en fyrir αS/ΔNt-Tau.Það voru engir aðgreindir blettir í dropum pLK og Tau kerfa sem voru óhæf til samruna/bleytu.Til að prófa hvort þessir blettir sem innihalda αS og Tau441 séu amyloid-líkir agnir, gerðum við svipaða tilraun með því að nota CF smásjá þar sem Tau441 var merkt með Atto647N og 12,5 μM amyloid-sértækt thioflavin-T (ThT) var bætt við frá upphafi.litarefni.Þrátt fyrir að ThT-litun á αS/Tau441 dropum eða flekum hafi ekki sést jafnvel eftir 24 klst ræktun (mynd 5b, efstu röð - dropar sem eftir eru yfir próteinflekum), voru ThT-jákvæðar mannvirki sem innihéldu Atto647N-Tau441 inni í flekunum mjög veik.þetta endurtekur stærð, lögun og staðsetningu blettanna sem áður hefur verið lýst (mynd 5b, mið- og neðst raðir), sem bendir til þess að blettirnir geti samsvarað amyloid-líkum efnasamböndum sem myndast í öldrunarvökvacoacervate.
WF 25 μM αS á ýmsum ræktunartímum og brennivíddshæðum (z, fjarlægð frá óbundnum botni) í viðurvist 25 μM Tau441 (1 μM AF488-merkt αS og Atto647N-merkt Tau441) í brunni í smásjárplötu með LLPS biðminni) .Sex tilraunir voru endurteknar sjálfstætt með svipuðum niðurstöðum.b CF smásjá mynd af 25 μM αS í viðurvist 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-merkt Tau441) og 12,5 μM thioflavin-T (ThT).Vegnir próteindropar og útfelldir próteinflekar og blettir eru sýndir í efstu og miðri röð, í sömu röð.Neðri röðin sýnir myndir af flekum og dropum frá 3 sjálfstæðum afritum.Hvítar örvar gefa til kynna ThT-jákvæða punkta á báðum spjöldum.Kvarðarstikan fyrir allar myndir er 20 µm.
Til að skoða nánar breytingar á coacervate próteinnetinu við umskipti frá vökva í fast efni, notuðum við flúrljómunarlíftímamyndgreiningu (FLIM) og Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (mynd 6 og viðbótarmyndir 8 og 9).Við gerðum þá tilgátu að coacervate þroskun lagsins í þéttari eða jafnvel fastri líkri samansafnuðu próteinbyggingu leiði til nánari snertingar á milli próteinsins og flúrljómandi rannsakans sem er tengdur við það, sem gæti hugsanlega valdið slökkviáhrifum sem koma fram í styttri líftíma rannsakanda (τ) , eins og áður hefur verið lýst40.,41 ,42.Að auki, fyrir tvöfalt merkt sýni (AF488 og Atto647N sem FRET gjafa og viðtakandi litarefni, í sömu röð), getur þessari lækkun á τ einnig fylgt coacervate þéttingu og aukningu á FRET(E) skilvirkni meðan á LSPT stendur.Við fylgdumst með fleka- og blettamyndun með tímanum í LLPS αS/Tau441 og αS/ΔNt-Tau sýnum (25 µM af hverju próteini í LLPS buffer sem inniheldur 1 µM AF488 merkt αS og/eða Atto647N merkt Tau441 eða ΔNt-Tau).Við sáum almenna tilhneigingu að því leyti að flúrljómunarlíftími AF488 (τ488) og Atto647N (τ647N) rannsakanna minnkaði lítillega eftir því sem coacervates þroskast (mynd 6 og viðbótarmynd 8c).Athyglisvert er að þessi breyting var verulega aukin fyrir punkta innan fleka (mynd 6c), sem gefur til kynna að frekari próteinþétting hafi átt sér stað við punkta.Þessu til stuðnings kom ekki fram nein marktæk breyting á líftíma flúrljómunar fyrir αS/ΔNt-Tau dropa sem voru gamlir í 24 klst. (aukamynd. 8d), sem bendir til þess að dropahlaup sé ferli sem er ólíkt blettablæðingum og fylgir ekki umtalsverðri endurskipulagningu sameinda. innan coacervates.Það skal tekið fram að punktarnir hafa mismunandi stærðir og breytilegt innihald í αS, sérstaklega fyrir αS/Tau441 kerfið (aukamynd 8e).Lækkunin á líftíma blettaflúrljómunar fylgdi aukning á styrkleika, sérstaklega fyrir Atto647N merkt Tau441 (aukamynd. 8a), og meiri FRET skilvirkni fyrir bæði αS/Tau441 og αS/ΔNt-Tau kerfi, sem gefur til kynna frekari þéttingu í LLPS fimm klukkustundum eftir ræsingu þéttust próteinin inni í stöðurafmagni.Í samanburði við αS/ΔNt-Tau, sáum við lægri τ647N og nokkuð hærri τ488 gildi í αS/Tau441 blettum, ásamt lægri og ójafnari FRET gildi.Hugsanlega gæti þetta tengst þeirri staðreynd að í αS/Tau441 kerfinu er αS magnið sem sést og búist er við í fyllingum ólíkara, oft undirstoichiometric miðað við Tau, þar sem Tau441 sjálft getur einnig gengist undir LLPS og samsöfnun (aukamynd. 8e) .Hins vegar er magn dropasamruna, flekamyndunar og, mikilvægara, próteinsamsöfnun innan vökvalíkra coacervata hámark þegar bæði Tau441 og αS eru til staðar.
a Lifetime fluorescence microscopy (FLIM) myndir af αS/Tau441 og αS/ΔNt-Tau við 25 μM af hverju próteini (1 μM AF488-merkt αS og 1 μM Atto647N-merkt Tau441 eða ΔNt-Tau) í jafnalausn.Dálkarnir sýna dæmigerðar myndir af LLPS sýnum á mismunandi þroskatíma (30 mín, 5 klst og 24 klst).Rauði ramminn sýnir svæðið sem inniheldur αS/Tau441 bletti.Líftími er sýndur sem litastikur.Kvarðarstika = 20 µm fyrir allar myndir.b Aðdráttarmynd FLIM af völdu svæði, sýnd í rauða reitnum í spjaldi a.Lífssvið eru sýnd með sama litakvarða og í spjaldi a.Skalastrik = 5 µm.c Vefrit sem sýna AF488 (tengt við αS) eða Atto647N (tengt við Tau) fyrir mismunandi próteintegundir (dropar-D-, raft-R- og flekk-P) auðkenndar í FLIM myndum sem skráðar eru fyrir αS-) tímasetningardreifingu líftíma Tau441 og αS/ΔNt-Tau coacervate sýni (N = 17-32 arðsemi fyrir D, 29-44 arðsemi fyrir R og 21-51 arðsemi fyrir stig).Meðalgildi og miðgildi eru sýnd sem gulir ferningar og svartar línur innan í reiti, í sömu röð.Neðri og efri mörk reitsins tákna fyrsta og þriðja fjórðungsmarkið, í sömu röð, og lágmarks- og hámarksgildi innan 1,5-falt millifjórðungssviðs (IQR) eru sýnd sem whiskers.Útlægir eru sýndir sem svartir tíglar.Tölfræðileg marktækni milli dreifingarpara var ákvörðuð með því að nota tveggja úrtak t-próf, þar sem gert er ráð fyrir ójöfnum dreifni.Tvíhliða p-gildi fyrir t-próf ​​eru sýnd með stjörnum fyrir hvert par af samanburðargögnum (* p-gildi > 0,01, ** p-gildi > 0,001, *** p-gildi > 0,0001, **** p-gildi > 0,00001), ns Gefur til kynna hverfandi (p-gildi > 0,05).Nákvæm p-gildi eru gefin upp í viðbótartöflu 1 og upprunalegu gögnin eru sett fram sem hrágagnaskrár.
Til að sýna frekar fram á amyloid-líka eðli blekkja/samstæðu, meðhöndluðum við ólituð coacervate sýni í 24 klukkustundir með háum styrk (1 M) NaCl, sem leiddi til aðskilnaðar samlags frá prótein coacervate.Þegar einangruð fylling (þ.e. dreifð lausn af fylliefnum) sást með atómsmásjá (AFM), sáum við aðallega kúlulaga formgerð með reglulegri hæð um 15 nm, sem hefur tilhneigingu til að tengjast við aðstæður með háum saltstyrk, svipað og hegðun dæmigerðra amyloid fibrils vegna sterkra vatnsfælna áhrifa á yfirborðið (athugið að fibrils hafa venjulega ~10 nm hæð) (aukamynd 10a).Athyglisvert er að þegar einangruð fylling var ræktuð með ThT í stöðluðu ThT flúrljómunarprófi, sáum við stórkostlega aukningu á ThT flúrljómunar skammtaafköstum, sambærilegt við það sem sést þegar litarefnið var ræktað með dæmigerðum αS amyloid fibrils (aukamynd 10b), sem bendir til þess að coacervate-samstæðurnar innihalda amyloid-líkar byggingar..Reyndar þola efnasamböndin háan saltstyrk en viðkvæm fyrir 4 M guanidínklóríði (GdnHCl), eins og dæmigerðar amyloid fibrils (aukamynd 10c).
Því næst greindum við samsetningu safnefna með því að nota eins sameindarflúrljómun, sértæka flúrljómunarfylgni/krossfylgni litrófsgreiningu (FCS/FCCS) og sprungugreiningu á tveggja lita tilviljunargreiningu (TCCD).Í þessu skyni einangruðum við agnir sem mynduðust eftir 24 klukkustunda ræktun í 100 μl LLPS sýnum sem innihéldu αS og Tau441 (bæði 25 μM) ásamt 1 μM AF488-merktu αS og 1 μM Atto647N-merktu Tau4411.Þynntu dreifðu samsafnalausnina sem myndast í einsameinda ástand með því að nota sama PEG-fría jafnalausn og 1 M NaCl (sama jafnalausn sem notaður er til að aðskilja agnir frá coacervate) til að koma í veg fyrir hugsanleg rafstöðueiginleika milli LLPS og próteins.Dæmi um tímaferil einnar sameindar má sjá á mynd 7a.FCCS/FCS greining (krossfylgni, CC og sjálfsfylgni, AC) sýndi að magn sem inniheldur αS og tau var mikið í sýnunum (sjá CC feril á mynd 7b, vinstra spjaldið), og ofgnótt af einliða próteini leifar varð til sem afleiðing af þynningarferlinu (sjá AC ferlar á mynd 7b, vinstra spjaldið).Samanburðartilraunir sem gerðar voru við sömu lausnaraðstæður með því að nota sýni sem innihéldu eingöngu einliða prótein sýndu engar CC ferlar og AC ferillarnir passa vel við einsþátta dreifingarlíkanið (Eq. 4), þar sem einliða prótein hafa væntanlega dreifingarstuðla (Mynd 7b) ), hægri spjaldið).Dreifingarstuðull samansafnaðra agna er minni en 1 µm2/s og einliða próteina er um 1 µm2/s.50–100 µm/s;gildin eru svipuð og áður birt gildi fyrir hljóðbeitt αS amyloid fibrils og monomeric αS sérstaklega við svipaðar lausnaraðstæður44.Þegar við greindum fyllingarnar með TCCD sprengingargreiningu (mynd 7c, efsta spjaldið), komumst við að því að í hverri einangruðu fyllingu (αS/Tau heteroaggregate), innihéldu um 60% af greindum fyllingum bæði αS og tau, um 30% innihéldu aðeins tau, aðeins um 10% αS.Stoichiometric greining á αS/Tau heteroaggregates sýndi að flest heteroaggregates voru auðguð á tau (stoichiometric lægri en 0,5, meðalfjöldi tau sameinda á hvert safn er 4 sinnum fleiri en αS sameindir), sem er í samræmi við vinnu okkar sem sést í FLIM in situ tilraunir..FRET greining sýndi að þessi einingar innihéldu bæði prótein, þó að raunveruleg FRET gildi í þessu tilfelli skipti ekki miklu máli, þar sem dreifing flúorófóra í hverri blöndu var tilviljunarkennd vegna ofgnóttar af ómerktu próteini sem notað var í tilrauninni.Athyglisvert er að þegar við gerðum sömu greiningu með því að nota 45,46 þroskaða amyloid samloðun-snauðu Tau afbrigðið (sjá viðbótarmynd 11a, b), tókum við eftir því að þó að rafstöðueiginleiki αS væri sú sama (aukamynd 11c, d), hæfni til að mynda safnefni innan coacervatsins minnkaði verulega og FLIM fann nokkra bletti í tilraunum á staðnum og veikar krossfylgniferlar sáust fyrir einangruð safnsýni.Hins vegar, fyrir lítinn fjölda greindra fyllinga (aðeins einn tíundi af Tau441), sáum við að hvert safn var auðgað af αS en þetta Tau afbrigði, þar sem um það bil 50% af greindu fyllingunum innihéldu aðeins αS sameindir og αS var misleitt umfram .samanlagðar (sjá viðbótarmynd 11e), öfugt við ólíku samlagnir sem myndast af Tau441 (mynd 6f).Niðurstöður þessara tilrauna sýndu að þó að αS sjálft sé fær um að safnast fyrir með tau innan kóacervatsins, þá er tau kjarnamyndun hagstæðari við þessar aðstæður, og amyloid-líkar agnir sem myndast geta virkað sem form αS og tau.Hins vegar, þegar tau-ríkur kjarni hefur myndast, eru gagnkvæmar víxlverkanir milli αS og tau ívilnandi í söfnun umfram homotypic víxlverkanir milli tau sameinda;við fylgjumst líka með próteinnetum í fljótandi αS/tau coacervate.
a Fulltrúi flúrljómunar tímabundinna leifar af stakum sameindum einangraðra efna sem myndast í αS/Tau441 rafstöðueiginleikum.Sprungur sem samsvara αS/Tau441 samsettum (sprungur yfir tilgreindum þröskuldi) sáust í þremur greiningarrásum (AF488 og Atto647N losun eftir beina örvun, bláar og rauðar línur, Atto647N losun eftir óbeina örvun), FRET, fjólublá lína).b FCS/FCCS greining á sýni af einangruðum αS/Tau441 efnasamböndum sem fengust úr LLPS (vinstra spjaldið).Sjálffylgni (AC) ferlar fyrir AF488 og Atto647N eru sýndir í bláu og rauðu, í sömu röð, og krossfylgni (CC) ferlar sem tengjast fyllingum sem innihalda bæði litarefnin eru sýndar í fjólubláu.AC kúrfurnar endurspegla nærveru merktra einliða og samsafnaðra próteinategunda, en CC ferlurnar sýna aðeins dreifingu tvímerktra agna.Sama greining, en við sömu lausnaraðstæður og í einangruðum blettum, eru sýni sem innihalda eingöngu einliða αS og Tau441 sýnd sem viðmið í hægra spjaldi.c Flúrljósgreining á stakum sameindum einangraðra efna sem myndast í αS/Tau441 rafstöðueiginleikum.Upplýsingar fyrir hverja heild sem finnast í fjórum mismunandi endurtekningum (N = 152) eru settar saman á móti stoichiometry þeirra, S gildi og FRET skilvirkni (efri spjaldið, litaslá endurspeglar atvik).Hægt er að greina þrjár gerðir af söfnun: -αS-einungis söfnun með S~1 og FRET~0, Tau-einungis söfnun með S~0 og FRET~1, og ólík Tau/αS söfnun með millistig S og FRET Mat á magni af báðum merkjapróteinum sem greindust í hvoru ólíku safni (N = 100) eru sýndar í neðri spjaldinu (litakvarðinn endurspeglar tilvikið).Hrágögn eru veitt í formi hrágagnaskráa.
Greint hefur verið frá því að þroska eða öldrun fljótandi próteinþéttiefna í hlauplík eða föst kerfi með tímanum tengist nokkrum lífeðlisfræðilegum aðgerðum þéttivatnsins47 sem og sjúkdómum, sem óeðlilegt ferli á undan amyloid samloðun 7, 48, 49. Hér við skoðum áfangaaðskilnað og hegðun í smáatriðum.LSPT αS í viðurvist handahófskenndra fjölkatjóna í stýrðu umhverfi við lágan míkrómólstyrk og lífeðlisfræðilega viðeigandi aðstæður (athugið að útreiknaður lífeðlisfræðilegur styrkur αS er >1 µM50), eftir dæmigerðri varmafræðilega knúinni hegðun LPS.Við komumst að því að αS, sem inniheldur mjög neikvætt hlaðið C-endasvæði við lífeðlisfræðilegt pH, getur myndað próteinríka dropa í vatnslausn með LLPS í nærveru mjög katjónískra röskunar peptíða eins og pLK eða Tau í gegnum rafstöðueiginleikann. flókin þétting í viðurvist samsöfnunar stórsameinda.Þetta ferli getur haft viðeigandi áhrif í frumuumhverfinu þar sem αS lendir í ýmsum fjölkatjónískum sameindum sem tengjast sjúkdómstengdri samloðun sinni bæði in vitro og in vivo51,52,53,54.
Í mörgum rannsóknum hefur próteinvirkni innan dropa verið talin einn af lykilþáttunum sem ákvarða þroskaferlið55,56.Í rafstöðueiginleikum αS coacervates með fjölkatjónum, fer þroskaferlið greinilega háð styrk víxlverkana við fjölkatjónir, gildið og fjölbreytni þessara víxlverkana.Jafnvægiskenningin bendir til þess að jafnvægislandslag tveggja fljótandi ástands væri tilvist stórs dropa sem er ríkur af líffjölliðum sem knýja áfram LLPS57,58.Dropavöxtur er hægt að ná með Ostwald-þroska59, samruna60 eða neyslu á frjálsri einliða í dreifða fasanum61.Fyrir αS og Tau441, ΔNt-Tau eða pLK var megnið af próteininu þétt í þéttivatninu við þær aðstæður sem notaðar voru í þessari rannsókn.Hins vegar, þó að tau-dropar í fullri stærð runnu hratt saman við yfirborðsbleytingu, var dropasamruni og bleyta erfitt fyrir ΔNt-Tau og pLK, sem bendir til hraðs taps á vökvaeiginleikum í þessum tveimur kerfum.Samkvæmt FLIM-FRET greiningu okkar sýndu öldruðu pLK og ΔNt-Tau droparnir svipaða próteinsamruna (svipuð flúrljómunartíma) og upprunalegu droparnir, sem bendir til þess að upprunalega próteinnetinu hafi verið haldið, þó stífara.
Við hagræðum tilraunaniðurstöður okkar í eftirfarandi líkani (mynd 8).Upphaflega tímabundið mynduðu droparnir eru oft próteinkerfi án rafstöðuuppbótar, og því eru svæði með hleðsluójafnvægi, sérstaklega við dropaskil, sem leiðir til dropa með mikla rafstöðueiginleika yfirborðsgetu.Til að bæta upp hleðslu (fyrirbæri sem almennt er nefnt gildisrýrnun) og lágmarka yfirborðsmöguleika dropanna, geta droparnir innihaldið ný fjölpeptíð úr þynntum fasa, endurskipulagt próteinkerfi til að hámarka hleðslu-hleðslu samskipti og haft samskipti við aðra dropa.með yfirborði (bleyta).αS/pLK droparnir, vegna einfaldara próteinnets þeirra (aðeins ólíkar víxlverkanir milli αS og pLK) og meiri sækni í prótein-prótein víxlverkanir, virðast geta jafnað hleðslu þéttivatnsins hraðar;Reyndar sáum við hraðari próteinhvörf í upphaflega mynduðum αS/pLK coacervate en í αS/Tau.Eftir gildisþurrð verða víxlverkanirnar minna skammvinnar og droparnir missa vökvaeiginleika sína og breytast í hlauplíka, óeldfima dropa með litla rafstöðueiginleika yfirborðsgetu (og geta því ekki bleyta yfirborðið).Aftur á móti eru αS/Tau dropar minna duglegir við að hámarka hleðslujafnvægi dropa vegna flóknari próteinneta (með bæði einstýpískum og heterotypic víxlverkunum) og veikari eðli próteinsamskipta.Þetta leiðir til dropa sem halda vökvahegðun í langan tíma og sýna mikla rafstöðueiginleika yfirborðsgetu sem hefur tilhneigingu til að vera lágmarkaður með því að sameinast og vaxa (þannig lágmarka yfirborðsflatarmál/rúmmálshlutfall dropanna) og með því að bleyta vatnssækna yfirborðsefnaefnið.Þetta skapar stór einbeitt prótínsöfn sem halda vökvaeiginleikum þar sem samskiptin eru mjög tímabundin vegna stöðugrar leitar að hleðsluhagræðingu í próteinkerfinu.Athyglisvert er að N-endalega stytt form Tau, þar á meðal sum náttúruleg ísóform62, sýna miðlungshegðun, þar sem sum coacervats eldast með αS í langlífa gellíka dropa, á meðan önnur umbreytast í stóra fljótandi þéttingu.Þessi tvíþætting í þroska αS rafstöðueiginleika samsetta er í samræmi við nýlegar LLPS fræðilegar og tilraunarannsóknir sem hafa bent á fylgni milli gildisþurrðar og rafstöðueiginleika í þéttiefni sem lykill að því að stjórna stærð þéttivatns og vökvaeiginleika.Vélbúnaður 58,61.
Þetta kerfi sýnir hugsanlega amyloid samloðun ferli fyrir αS og Tau441 í gegnum LLPS og LSPT.Með viðbótar anjónaríkum (rauðum) og katjónríkum (bláum) svæðum, hafa αS og tau rafstöðueiginleikar með fullnægjandi gildi lægri yfirborðsorku og þar af leiðandi minni samruna, sem leiðir til hröðrar öldrunar dropa.Stöðugt ósamsett hlaupástand næst..Þetta ástand er mjög hagstætt þegar um er að ræða αS/pLK kerfið vegna meiri sækni þess og einfaldara prótein-par víxlverkunarnet, sem gerir kleift að hraða hlauplík umskipti.Þvert á móti, dropar með ófullnægjandi gildi og þar af leiðandi próteinhlaðinn svæði sem eru tiltæk fyrir víxlverkun, auðvelda coacervatinu að sameinast og bleyta vatnssækna yfirborðið til að draga úr mikilli yfirborðsorku þess.Þetta ástand er æskilegt fyrir αS/Tau441 coacervata, sem hafa fjölgild flókið net sem samanstendur af veikum Tau-Tau og αS-Tau víxlverkunum.Aftur á móti munu stærri coacervates auðveldara halda vökvalíkum eiginleikum sínum, sem gerir öðrum prótein-við-prótein víxlverkun kleift að eiga sér stað.Að lokum myndast amyloid heterogene agnir sem innihalda bæði αS og tau í coacervate vökvanum, sem geta tengst þeim sem finnast í inclusion bodies, sem eru einkenni taugahrörnunarsjúkdóma.
Stóru vökvalíku mannvirkin sem myndast við þroska αS/Tau441 með mjög stíflað en kraftmikið próteinumhverfi og, í minna mæli, αS/ΔNt-Tau coacervates eru tilvalin geymir fyrir kjarnamyndun próteinsamruna.Við höfum svo sannarlega fylgst með myndun föstu próteinagrindanna í þessari tegund af próteinkervötum, sem oft innihalda bæði αS og tau.Við höfum sýnt fram á að þessi heteroaggregates eru stöðug með víxlverkunum sem ekki eru rafstöðueiginleikar, geta bundið amyloid-sértæk ThT litarefni á sama hátt og dæmigerð amyloid fibrils og hafa reyndar svipaða mótstöðu gegn ýmsum áhrifum.Sýnt var fram á að αS/tau einingar sem myndast af LLPS hafi amyloid-líka eiginleika.Reyndar er þroskað afbrigði af Tau sem skortir á amyloid samloðun verulega skert í myndun þessara ólíku αS einingar innan fljótandi rafstöðueiginleika coacervate.Myndun á αS/Tau441 efnasamböndum sást aðeins inni í coacervötunum, sem héldu vökvalíkum eiginleikum, og aldrei ef coacervatin/droparnir náðu ekki hlaupi.Í síðara tilvikinu kemur aukinn styrkur rafstöðueiginleika milliverkana og þar af leiðandi stífni próteinkerfisins í veg fyrir nauðsynlega sköpulagsbreytingar próteina til að koma á nýjum próteinvíxlverkunum sem eru nauðsynlegar fyrir amyloid kjarnamyndun.Hins vegar er hægt að ná þessu með sveigjanlegri, vökvalíkum coacervate, sem aftur eru líklegri til að haldast fljótandi eftir því sem þau stækka.
Sú staðreynd að myndun fyllinga innan þétta fasans er æskileg í stórum αS/Tau þéttum en í litlum dropum sem gela hratt, undirstrikar mikilvægi þess að greina þá þætti sem stjórna dropasamruna.Þannig er ekki aðeins tilhneiging til fasaaðskilnaðar, heldur verður að stjórna stærð þéttivatnsins til að virka sem og koma í veg fyrir sjúkdóma58,61.Niðurstöður okkar sýna einnig mikilvægi jafnvægis milli LLPS og LSPT fyrir αS/Tau kerfið.Þó að dropamyndun geti verndað gegn amyloid samloðun með því að draga úr magni próteineinliða sem er tiltækt við mettunaraðstæður, eins og lagt hefur verið til í öðrum kerfum63,64, getur dropasamruni við hátt dropastig leitt til innri próteinasamsöfnunar með hægum endurröðun.prótein net..
Í heildina leggja gögn okkar mikla áherslu á mikilvægi samloðandi gildis og ánægðra/óánægðra samskipta í fallnetum í samhengi við LSPT.Sérstaklega sýnum við að αS/Tau441 þéttingar í fullri lengd geta á skilvirkan hátt sameinast og kjarna til að mynda amyloid-eins heteroaggregates sem innihalda bæði prótein og leggja til sameindakerfi byggt á niðurstöðum tilrauna okkar.Samsöfnun tveggja próteina í αS/Tau vökva coacervate sem við greinum frá hér gæti vissulega tengst samstaðsetningu tveggja próteina í innfellingum, sem eru einkenni sjúkdómsins, og getur stuðlað að skilningi á tengslum LLPS og amyloid samsöfnun, sem ryður brautina fyrir mjög hlaðna IDP í taugahrörnun.
Einliða WT-αS, cysteine ​​stökkbrigði (Q24C-αS, N122C-αS) og ΔCt-αS afbrigði (Δ101-140) voru tjáð í E. coli og hreinsuð eins og áður hefur verið lýst.5 mM DTT var innifalið í öllum skrefum í hreinsun á αS cysteine ​​stökkbreyttum til að koma í veg fyrir myndun tvísúlfíðtengja.Tau441 ísóform (plasmíð fengin úr Addgene #16316), ΔNt-Tau afbrigði (Δ1–150, fengin með því að klóna IVA með frumurum CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) og AggDef-2CT afbrigði hreinsaðs með EggDef-1CT,5C afbrigði með EGGDef-1CT,5C. coli menningar voru vaxið í OD600 = 0,6–0,7 við 37°C og 180 snúninga á mínútu, og tjáning var framkölluð með IPTG í 3 klukkustundir við 37°C.Uppskeru frumur við 11.500 xg í 15 mínútur við 4 °C og þvoðu með saltlausn jafnalausn sem inniheldur 150 mM NaCl.Endurfleygðu kögglana í leysistuðpúða (20 ml á 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidín 50 μM, cópeptín 100).Sonication skrefið var framkvæmt á ís með amplitude 80% í 10 púls (1 mín á, 1 mín off).Ekki fara yfir 60 ml í einni ómskoðun.E. coli lýsöt voru hituð við 95°C í 20 mínútur, síðan kæld á ís og skilin í skilvindu við 127.000×g í 40 mínútur.Hreinsaða flotið var sett á 3,5 kDa himnu (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Bretlandi) og skilað gegn 4 L af skilunarbuffi (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) í 10 klukkustundir.5 ml katjónaskiptasúla (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) var sett í jafnvægi með jafnvægisbuffi (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lysatið var síað í gegnum 0,22 μm PVDF síu og sprautað inn í súluna með flæðihraða 1 ml/mín.Skolun var framkvæmd smám saman, tau var skolað með 15–30% skolunarjafna (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Hlutar voru greindir með SDS-PAGE og allir hlutar sem innihéldu eitt band með væntanlegan mólmassa tau voru þéttir með því að nota 10 kDa skilvindusíu og skipt út fyrir jafna sem innihélt 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM og DTT 2 mM fyrir endanleg próteinstyrkur var 100 μM.Próteinlausnin var síðan látin fara í gegnum 0,22 μm PVDF síu, fljótfryst og geymd við -80°C.Prótein K18 var vinsamlega veitt af prófessor Alberto Boffi.Hreinleiki efnablöndunnar var >95% eins og staðfest var með SDS-PAGE og MALDI-TOF/TOF.Ýmis cystein voru efnafræðilega merkt með AlexaFluor488-maleimíði (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) eða TEMPOL-maleimíði (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).voru staðfestar með gleypni og MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau og K18 voru merkt með upprunalegum cysteinleifum í stöðu 191 og 322 með Atto647N-maleimidi (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Þýskalandi) eftir sömu aðferð.Nettóhleðsla á leifakort fyrir αS og Tau441 voru mynduð með því að nota CIDER66.
Fast pólý-L-lýsín (pLK DP 90-110 samkvæmt NMR frá birgi, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, Bandaríkjunum) var leyst upp í 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 til 10 mM styrk, aðferð hljóðbeitt í 5 mínútur í ultrasonic vatnsbaði og geyma við -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) og FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, Bandaríkjunum) eru vatnsleysanleg og dreift víða í LLPS jafnalausn.Skilun fjarlægir mengandi sölt.Þau voru síðan síuð í gegnum sprautusíu með 0,22 μm holastærð og styrkur þeirra reiknaður út með ljósbrotsmæli (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, Bandaríkjunum).LLPS sýni voru útbúin við stofuhita í eftirfarandi röð: stuðpúða og útpressun var blandað saman og 1 mM tris(2-karboxýetýl)fosfín (TCEP, Carbosynth, Compton, Bretlandi), 1 mM 2,2,2,2-(Etan- 1,2-díýldínítríl) tetraediksýra (EDTA, karboxínt) og blöndu af 1% próteasahemli (PMSF 100 mM, bensímíð 1 mM, leupeptín 5 μM).Síðan er αS og sameinuðum fjölkatjónum (valkostum pLK eða Tau) bætt við.Fyrir thioflavin-T tímaraðar tilraunir (ThT, Carbosynth, Compton, Bretlandi), notaðu heildarstyrk ThT til að vera helmingur αS styrks.Blandið sýnunum varlega en vandlega saman til að tryggja að þau séu einsleit.Styrkur hvers efnisþáttar var mismunandi eftir tilraunum, eins og lýst er í Niðurstöðuhlutanum.Azíð var notað í styrk upp á 0,02% (w/v) hvenær sem lengd tilraunarinnar var lengri en 4 klst.Fyrir allar greiningar sem nota LLPS sýni, leyfðu blöndunni að ná jafnvægi í 5 mínútur fyrir greiningu.Til greiningar á ljósdreifingu var 150 µl af sýnum hlaðið á óbindandi 96-brunn örplötur (µClear®, svart, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austurríki) og þakið límfilmu.Fylgst var með LLPs með því að mæla gleypni við 350 nm í miðju lausnarinnar í CLARIOstar plötulesara (BMG Labtech, Ortenberg, Þýskalandi).Tilraunirnar voru gerðar í þrígangi við 25°C og voru villurnar reiknaðar sem staðalfrávik frá meðaltali.Þynnti fasinn var magngreindur með skilvindu sýnis og SDS-PAGE hlaupgreiningu og αS hluti í þynntum og óblandaðri fasa var magngreindur í ýmsum LLPS lausnum.100 μl LLPS sýni sem innihélt 1 μM AF488-merkt αS var útbúið með vandlegri blöndun og síðan skilvindu við 9600×g í 30 mínútur, eftir það sást botnfallið venjulega.Efstu 50 μl af flotinu voru notaðir til magngreiningar á próteinum með því að nota SDS-PAGE hlaup.Gel voru skannaðar með AF488 síum með því að nota ChemiDoc hlaupmyndakerfi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) eða lituð með Coomassie lit og sýnd með viðeigandi síum.Böndin sem fengust voru greind með ImageJ útgáfu 1.53i (National Institute of Health, USA).Tilraunirnar voru gerðar í tvítekningu í tveimur mismunandi tilraunum með svipaðar niðurstöður.
Venjulega voru 150 μl af sýnum sett á óbindandi 96-brunn örplötur og sýndar við stofuhita á Leica DMI6000B öfugum smásjá (Leica Microsystems, Wetzlar, Þýskalandi).Fyrir blettatilraunir voru einnig notaðar µ-Slide Angiogenesis plötur (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Þýskalandi) eða 96-brunn pólýstýren örplötur (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).EL6000 halógen eða kvikasilfurs málm halide lampar voru notaðir sem lýsingargjafar (fyrir BF/DIC og WF myndgreiningu, í sömu röð).Fyrir WF smásjárskoðun var loftmarkmið með 40x stækkun (Leica Microsystems, Þýskalandi) notað til að stilla ljósið á sýnið og safna því.Fyrir AF488 og ThT merkt sýni, síuörvun og losun með stöðluðum GFP síusettum, örvunar- og losunarbandpassasíur, í sömu röð, 460–500 nm og 512–542 nm bandpassasíur, og 495 nm tvíhliða spegil.Fyrir sýni merkt með Atto647N var notað staðlað sett af Cy5 síum með örvunar- og útblástursbandpassasíur 628–40 nm og 692–40 nm, í sömu röð, og 660 nm tvíhliða spegil.Fyrir BF og DIC smásjárskoðun, notaðu sama endurkastsljóssöfnunarmarkmiðið.Ljósið sem safnað var var tekið upp á Leica DFC7000 CCD myndavél (Leica Microsystems, Þýskalandi).Lýsingartíminn var 50 ms fyrir BF og DIC smásjámyndatöku og 20-100 ms fyrir WF smásjármyndatöku.Til samanburðar var útsetningartími allra tilrauna með ThT 100 ms.Time-lapse tilraunir voru gerðar til að sjá dropasamruna, þar sem myndum var safnað á 100 ms fresti í nokkrar mínútur.ImageJ (NIH, USA) var notað við myndgreiningu.Tilraunirnar voru gerðar í þríriti með svipuðum árangri.
Fyrir sambyggðartilraunir, FRAP og þrívíddaruppbyggingu, voru myndir teknar á Zeiss LSM 880 öfugsnúinni confocal smásjá með ZEN 2 blári útgáfu (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Þýskalandi).Sýni af 50 µl voru sett á µ-Slide Angiogenesis Petri diska (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Þýskalandi), meðhöndluð með vatnssækinni fjölliðu (ibiTreat) og sett í 63× olíudýfingarhlutfall (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) á DIC).Myndir voru teknar með 458 nm, 488 nm og 633 nm argon leysislínum með upplausn 0,26 µm/pixla og lýsingartíma 8 µs/pixla fyrir örvunar- og útblástursskynjunarglugga á 470–600 nm, 493–628 nm, 628 nm. og 638–755 nm var notað til að sjá ThT, AF488 og Atto647N, í sömu röð.Fyrir FRAP tilraunirnar var tíma-lapse ljósmyndun af hverju sýni tekin með 1 ramma á sekúndu.Tilraunirnar voru gerðar í þríriti við stofuhita með svipuðum árangri.Allar myndir voru greindar með Zen 2 blue edition hugbúnaði (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Þýskalandi).FRAP kúrfurnar voru staðlaðar, teiknaðar og lagaðar að styrkleika/tíma gögnum sem dregin voru út úr myndum með Zen 2 með OriginPro 9.1.Endurheimtarferlarnir voru settir á einveldislíkan til að gera grein fyrir sameindadreifingu með viðbótar veldisvísisheiti til að gera grein fyrir öflunarbleikjuáhrifum.Við reiknuðum síðan D með því að nota nafnbleikingarradíus og áður ákvarðaðan helmingunartíma bata eins og í jöfnu Kang o.fl.5 35 sýnd.
Einstök cystein afbrigði af αS voru mynduð með 4-hýdroxý-2,2,6,6-tetrametýlpíperidíni-N-oxýli (TEMPOL) í stöðu 24 (TEMPOL-24-αS) og 122 (TEMPOL-122-αS), í sömu röð.Snúningsmerking Fyrir EPR tilraunir var αS styrkurinn stilltur á 100 μM og PEG styrkurinn var 15% (w/v).Fyrir ýmsar samsöfnunaraðstæður var αS:pLK hlutfallið 1:10, en αS:ΔNt-Tau og αS:Tau441 hlutföllunum var haldið við 1:1.Fyrir bindandi títrunartilraunir í fjarveru á þrengingu var TEMPOL-122-αS haldið við 50 μM og fjölkatjónir voru títraðar í vaxandi styrk, undirbúið hvert ástand fyrir sig.CW-EPR mælingar voru gerðar með Bruker ELEXSYS E580 X-band litrófsmæli með Bruker ER4118 SPT-N1 resonator sem starfar við örbylgjuofn (SHF) tíðni ~9,7 GHz.Hitastigið var stillt á 25°C og stjórnað með fljótandi köfnunarefnis frystistilli.Litrófið var náð við ómettaðar aðstæður við MW afl 4 mW, mótunaramplitude 0,1 mT og mótunartíðni 100 kHz.Litrófsstyrkur var staðlaður til að forðast mun á snúningsstyrk milli sýna og mögulega snúningslækkun vegna afgangsstyrks afoxunarefna í sýnum sem innihalda Tau441 eða ΔNt-Tau (til staðar í upprunalegu próteinlausnunum).Uppgefin gildi g voru fengin sem afleiðing af EPR litrófslíkönum sem framkvæmd var með því að nota Easyspin hugbúnaðinn (v. 6.0.0-dev.34) innleiddur í Matlab®67.Ein/tveir íhluta samsætulíkön voru notuð til að móta gögnin.Eftir að hafa staðlað öll merki voru leifar reiknaðar með því að draga hverja uppgerð frá samsvarandi tilraunarófi.Fyrir bindingartítrunargreiningu var hlutfallslegur styrkleiki þriðja bandsins við annað band hins eðlilega EPR litrófs (IIII/III) notað til að fylgjast með bindingu fjölkatjóna við αS.Til að meta sundrunarfastann (Kd) var ferillinn sem fékkst settur á áætlað líkan þar sem gert er ráð fyrir n eins og óháðum bindistaði.
NMR litrófsgreiningartilraunir voru gerðar með Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR litrófsmæli útbúinn með kryoprobe og Z-stigli.Allar tilraunir voru gerðar með því að nota 130–207 µM αS og samsvarandi αS/ΔNt-Tau og pLK jafngildi í 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 og voru framkvæmdar við 15°C.Til að fylgjast með LPS með NMR var 10% PEG bætt við forblönduðu sýnin.Efnaskiptatruflanir (Mynd 1b) sýna meðaltal 1H og 15N efnabreytinga.αS 2D1H-15N HSQC litrófinu var úthlutað á grundvelli fyrri úthlutunar (BMRB færsla #25227) og staðfest með því að skrá og greina þrívíddarróf HNCA, HNCO og CBCAcoNH.13Cα og 13Cβ efnabreytingar voru reiknaðar í nærveru ΔNt-Tau eða pLK til að mæla mögulegar breytingar á þróun efri uppbyggingu samanborið við αS efnabreytingar í hreinni tilviljunarkenndri spólubyggingu 68 (viðbótarmynd 5c).R1ρ tíðnin voru mæld með því að taka upp hsqctretf3gpsi tilraunir (fengnar úr Bruker bókasafninu) með töfum upp á 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 og 800 ms, og veldisfallsföllin voru stillt að hámarkseinkennum. sinnum til að ákvarða R1ρ og tilraunaóvissu þess.
Tveggja lita tímaupplausnar flúrljómunarsmásjártilraunir voru gerðar á tímaupplausri MT200 flúrljómunarsmásjá (PicoQuant, Berlín, Þýskalandi) með tímatengdri einljóseindatalningu (TCSPC) tæki.Laserdíóðahausinn er notaður fyrir pulsed interleaved excitation (PIE), geislinn fer í gegnum einhams bylgjuleiðara og er stilltur á leysistyrk 10 til 100 nW fyrir 481 nm og 637 nm leysilínur mældar eftir tvíhliða spegil.Þetta tryggir ákjósanlegan ljóseindatalningarhraða, forðast áhrif ljóseindasamnefnis, ljósbleikingar og mettunar.μ-Slide angiogenesis covers eða plötur (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Þýskalandi) voru settir beint í dýfavatn yfir Super Apochromat 60x NA 1.2 linsu með leiðréttingarkraga (Olympus Life Sciences, Waltham, Bandaríkjunum).488/640 nm tvískiptur spegill (Semrock, Lake Forest, IL, Bandaríkjunum) var notaður sem aðalgeislaskiptir.Ófókusuð geislun er lokuð af gati sem er 50 míkron í þvermál, síðan er fókusgeisluninni skipt í 2 skynjunarleiðir með 50/50 geislaskiptari.Bandpass losunarsíur (Semrock, Lake Forest, IL, Bandaríkjunum) 520/35 fyrir grænan litarefni (AF488) og 690/70 fyrir rauðan litarefni (Atto647N) voru notaðar fyrir framan skynjarann.Eins ljóseinda snjóflóðadíóða (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Ítalía) voru notaðar sem skynjarar.Bæði gagnasöfnun og greining voru framkvæmd með því að nota SymphoTime64 hugbúnaðinn sem er fáanlegur í sölu (PicoQuant GmbH, Berlín, Þýskalandi).
Fimmtíu míkrólítra af LLPS sýnum var borið á μ-Slide æðamyndunarholur (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Þýskalandi).Myndirnar sem myndast eru fókusaðar að 20 µm fyrir ofan brunnbotninn fyrir besta hlutlæga vinnslufjarlægð fyrir upphengda dropa og að ~1 µm fyrir fleka og punkta með ásupplausn sem er að minnsta kosti 0,25 µm/pixel og seinkun upp á 400 µs/pixla.Veldu gögn með því að beita styrkleikaþröskuldi sem byggir á meðalstyrkleika bakgrunnsmerkja (PBG, meðaltal + 2σ) fyrir hverja rás þannig að aðeins fljótandi próteindropar, flekar eða blettir séu valdir og síar út hvaða uppruna sem er úr dreifða fasanum.Til að greina líftíma hverrar tegundar (τ) hverrar rásar (grænn, „g“ fyrir AF488 og rauður, „r“ fyrir Atto647N), völdum við áhugaverð svæði (ROIs) sem innihalda dropa, fleka eða bletti (aukamynd 1) ).8b) og leiddu þær með því að passa líftíma rotnun þeirra (τD, τR og τP fyrir dropa, fleka eða bletti, í sömu röð, sjá viðbótarmynd 8c) í hverja rás með því að nota hala-fit greiningu og tveggja þátta rotnunarlíkan.Meðaltal τ frá τ .arðsemi sem framleiddi of fáar ljóseindir fyrir fjölveldispassun voru útilokuð frá greiningunni.Niðurskurðurinn sem notaður var var <104 ljóseindir fyrir fleka og punkta og 103 fyrir fall.Droparnir hafa lægri þröskuld vegna þess að erfitt er að fá hrörnunarferla með hærri styrkleikagildum, þar sem droparnir í myndsviðinu eru venjulega minni og færri.arðsemi með ljóseindafjölda yfir ljósasöfnunarmörkum (stillt á >500 talningar/pixla) var einnig hent til greiningar.Passaðu styrkleikarýrnunarferilinn sem fæst frá áhugasvæðinu við styrkleika sem er 90% af hámarkinu (örlítið á eftir hámarksstyrk hnignunarinnar) frá upphafi endingartíma til að tryggja lágmarks IRF truflun á sama tíma og það er sama fyrir alla styrkleikarýrnun stillingar Hlutfallslegur tímagluggi Var greindur 25 til 50 arðsemi fyrir fleka og bletti og 15-25 arðsemi fyrir dropa, myndir valdar úr fleiri en 4 endurtekningar teknar úr að minnsta kosti 3 sjálfstæðum tilraunum.Tvíhliða t-próf ​​hafa verið notuð til að meta tölfræðilegan mun milli tegunda eða á milli coacervate kerfa.Fyrir pixla-fyrir-pixla greiningu á líftímanum (τ), var heildardempun líftímans yfir sviðið fyrir hverja rás reiknuð út og nálgun á 2/3-þátta veldisdeyfingarlíkani framkvæmd.Lífsdeyfingin fyrir hvern pixla var síðan sett á með því að nota áður reiknuð τ gildi, sem leiddi til gervilita FLIM passa mynd.Lífstími skottloka var sá sami á öllum myndum af sömu rásinni og hver rotnun framleiddi nægilega margar ljóseindir til að tryggja áreiðanlega passa.Fyrir FRET greiningu voru pixlar valdir með því að nota lægri styrkleikaþröskuld 100 ljóseindir, sem var að meðaltali bakgrunnsmerki (FBG) 11 ljóseindir.Flúrljómunarstyrkur hverrar rásar var leiðréttur með tilraunaákvörðuðum leiðréttingarstuðlum: 69 litrófsvíxl α var 0,004, bein örvun β var 0,0305, greiningarvirkni γ var 0,517.FRET skilvirkni á pixlastigi er síðan reiknuð út með því að nota eftirfarandi jöfnu:
þar sem FDD er flúrljómunarstyrkur sem sést í gjafa (grænu) rásinni, FDA er flúrljómunarstyrkur sem sést í viðtakanda (rauðu) rásinni við óbeina örvun, og FAA er flúrljómunarstyrkur sem sést í viðtakanda (rauðu) rásinni við beina örvun ( BAKA).Flúrljómunarstyrkspúlsar sjást í rásinni).
Setjið 100 µl af LLPS hvarflausnum sem innihalda 25 µM ómerkt einliða Tau441 (með eða án 25 µM αS) í LLPS jafnalausn (uppbót eins og hér að ofan) á óbindandi 96-brunn örplötur með límþynnuhúð og dropamyndun var athugað með WF smásjá. jafnvægi.innan 10 mín.Eftir 48 klst ræktun við stofuhita var staðfest að próteinflekar og blettir væru til staðar.Fjarlægðu síðan vökvann varlega yfir flekana úr brunnunum, bættu síðan við 50 L af sundrunarbuffi (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) og ræktið í 10 mín.Hár saltstyrkur tryggir að LLPS endurtaki sig ekki vegna afgangs PEG og hugsanlegar próteinsamstæður sem myndast eingöngu við rafstöðueiginleikar verða teknar í sundur.Botn holunnar var síðan skafinn varlega af með örpípettuodda og lausnin sem fékkst var flutt í tóma athugunarholu.Eftir ræktun sýnanna með 50 μM ThT í 1 klst, var tilvist einangraðra bletta athugað með WF smásjá.Undirbúið hljóðbeitt αS fibrils með því að rækta 300 µl af 70-µM αS lausn í PBS með pH 7,4, natríumazíð 0,01% við 37 °C og 200 rpm á hringhristara í 7 daga.Lausnin var síðan skilin í skilvindu við 9600×g í 30 mínútur, kögglan var endurleyst í PBS pH 7,4 og hljóðbeitt (1 mín, 50% hringrás, 80% amplitude í Vibra-Cell VC130 hljóðtæki, Sonics, Newton, Bandaríkjunum) trefjasýni með tiltölulega einsleitri stærðardreifingu lítilla trefja.
FCS/FCCS greining og tveggja lita tilviljunargreining (TCCD) voru gerðar á sömu MT200 tímauppleystu flúrljómandi confocal smásjá (Pico-Quant, Berlín, Þýskalandi) sem notuð var fyrir FLIM-FRET smásjártilraunirnar með PIE ham.Lasaraflið fyrir þessar tilraunir var bætt við 6,0 µW (481 nm) og 6,2 µW (637 nm).Samsetning þessara leysikrafta var valin til að framleiða svipað birtustig fyrir pörin af flúorófórum sem notuð voru á meðan ákjósanlegur talningahraða var náð og forðast ljósbleiking og mettun.Bæði gagnasöfnun og greining voru framkvæmd með því að nota SymphoTime64 útgáfu 2.3 hugbúnaðinn sem er fáanlegur í sölu (PicoQuant, Berlín, Þýskalandi).
Sýni af einangruðum αS/Tau efnasamböndum sem fengin eru með LLPS eru þynnt í einangrunarjafna í viðeigandi einsameindastyrk (venjulega 1:500 þynning, þar sem efnasambönd eru þegar í lágum styrk þegar þau eru einangruð úr samþynningarsýnum).Sýni voru sett beint á hyljara (Corning, USA) sem voru forhúðaðir með BSA lausn í styrkleikanum 1 mg/ml.
Fyrir PIE-smFRET greiningu í grænu og rauðu rásinni var lægri styrkleikaþröskuldur upp á 25 ljóseindir beitt til að sía út lágstyrksmerki af völdum einliða atburða (athugið að einliða eru fleiri en samanlögð sýni samanborið við einangruð safnefni).Þessi þröskuldur var reiknaður út sem fimmfaldur meðalstyrkur einliða αS sem fékkst við greiningu á hreinum einliðasýnum til að velja sérstakt magn til greiningar.PIE drifrásin, ásamt TSCPC gagnaöflun, hefur gert kleift að beita lífstíðarvigtarsíu sem hjálpar til við að útrýma bakgrunni og litrófsvíxlun.Blossastyrkurinn sem valinn var með ofangreindum þröskuldum var leiðréttur með því að nota meðalbakgrunnsmerkið sem ákvarðað var út frá súluritum um tilvik á móti styrkleika/kassi sýnishornanna sem eingöngu voru í biðminni.Sprungur sem tengjast stórum samsöfnum taka venjulega nokkrar hólfa í röð í tímarekstrinum (stillt á 1 ms).Í þessum tilfellum var valinn bakki með hámarksstyrk.Fyrir FRET og stoichiometric greiningu var fræðilega ákvarðaður gamma þáttur γ (0,517) notaður.Spectral crosstalk og bein örvunarframlög eru hverfandi (ákvörðuð með tilraunum) við örvunarleysisaflið sem notað er.Skilvirkni og stoichiometry FRET í sprengingu er reiknuð út sem hér segir.