ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tvíhliða soðið rör fyrir efnaiðnað efnahluti, Skortur á SPECC1L leiðir til aukins stöðugleika skeyttra liða og minnkaðrar losunar á höfuðkúputaugafrumum.

Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Þú ert að nota vafraútgáfu með takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Að auki, til að tryggja áframhaldandi stuðning, sýnum við síðuna án stíla og JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tvíhliða soðið rör fyrir efnaiðnað

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.er leiðandi framleiðandi sem sérhæfir sig í ryðfríu stáli óaðfinnanlegur rör , björt annealed rör , óaðfinnanlegur coiled rör o.fl.Til þess að auðvelda viðskiptavinum höfum við einnig soðið rör og rör.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.er með fullkomnasta framleiðslu- og prófunarbúnaðinn.Við getum alveg fullnægt kröfum þínum.Samkvæmt stöðlum mjög strangt, hafa rör sem framleidd eru af okkur alltaf rétt OD og WT þol.Umburðarlyndiseftirlitið er nákvæmlega í samræmi við framleiðslustaðla.Vörur okkar eru alltaf ánægðar með viðskiptavini.Viðskiptavinir keyptu vörur okkar skapaði meiri hagnað.
a) OD (ytri þvermál): 3,18 mm til 101,6 mm
b) WT (veggþykkt): 0,5 mm til 20 mm
c) Lengd: Samkvæmt kröfu viðskiptavinarins
d) Staðlar: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 osfrv
e) Aðferðaraðferð: ERW, EFW osfrv

Rennistikur sem sýna þrjár greinar á hverri glæru.Notaðu til baka og næsta hnappa til að fara í gegnum glærurnar, eða rennibrautarhnappana í lokin til að fara í gegnum hverja glæru.
The cranial neural crest cells (CNCC) losna undan taugafellingum fósturvísa og flytjast yfir í kokbogana, sem mynda flestar miðjubyggingarnar.CNCC truflun gegnir mikilvægu hlutverki í orsökum munnholsklofs, sem er algengur meðfæddur vansköpun.Arfblendnar SPECC1L stökkbreytingar hafa fundist hjá sjúklingum með óhefðbundinn klof og heilkenni.Hér greinum við frá aukinni litun á canonical adhesive junction (AJ) íhlutum, β-catenin og E-cadherin í ræktuðum SPECC1L knockdown frumum og rafeindasmámyndir sýna apical-basal dreifingu AJ.Til að skilja hlutverk SPECC1L í höfuðbeinamyndun, bjuggum við til Specc1l skort múslíkan.Arfhreinir stökkbrigði eru banvænir í fósturvísum og sýna skerta lokun taugaröra og CNCC lamination.AJ próteinlitun er aukin í stökkbreyttum taugafellingum.Þessi AJ galli er í samræmi við galla í CNCC delamination, sem krefst AJ upplausnar.Að auki hafa Specc11 stökkbrigði dregið úr PI3K-AKT merkjum og aukið frumudauða.In vitro dugði væg hömlun á PI3K-AKT merkjum í villigerð frumum til að framkalla AJ breytingar.Mikilvægt er að AJ breytingar af völdum SPECC1L knockdown er hægt að snúa við með því að virkja PI3K-AKT ferlið.Samanlagt benda þessi gögn til þess að SPECC1L, sem nýr eftirlitsaðili fyrir PI3K-AKT merkjasendingar og AJ líffræði, sé nauðsynleg fyrir lokun taugaröra og CNCC lagskiptingu.
Cranial neural crest frumur (CNCCs) staðsetja sig í dorsal neuroectoderm og losna frá taugaþekju taugafellinga sem þróast í gegnum ferli sem felur í sér þekju-mesenchymal umskipti (EMT)1,2,3.Premigrating epithelial CNCCs trufla millifrumumót og verða til migrating mesenchymal CNCCs sem fylla fyrsta og annan kokboga og mynda mestan hluta höfuðbeinabrjósksins.Þannig eru gen sem stjórna starfsemi CNCC oft truflað í orsök meðfæddra höfuðbeinagalla eins og munnhols klofa, sem oftast hafa áhrif á 1/800 fæðingar í Bandaríkjunum einum.Ein af meðfæddu vansköpunum8.
Delamination á CNCC fellur saman við lokun fremri taugapípunnar á milli 8,5 og 9,5 daga fósturþroska í músum.Stökkbreytingar á fjölda gena sem tengjast munnholi músa sýna einnig einhvers konar taugagangagalla, þar á meðal Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 og Pdgfrα12.Hins vegar geta ferlar við lokun taugaslöngunnar og CNCC lagskiptingu talist óháðir, þar sem Splotch stökkbreytta músin (Pax3) sýnir galla í lokun taugaslöngunnar án nokkurra áhrifa á CNCC lagskiptingu eða fólksflutninga 13,14.Viðbótar múslíkön með galla í CNCC-krufningu og lokun taugaröra munu hjálpa til við að afmarka sameiginlegan sameindagrundvöll þessara tveggja ferla.
Einangrun CNCC frá taugaþekjufrumum krefst upplausnar á adhesive junctions (AJs), sem eru samsett úr próteinfléttum sem innihalda meðal annars E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin og α-actinin tengt aktínþráðum 2 Yfirtjáningarrannsóknir E-cadherin í taugafellingum sýndu minnkun eða seinkun á CNCC delamination.Aftur á móti leiðir bæling E-cadherins til snemmbúins lagskiptingar15,16.Margir af þeim þáttum sem miðla EMT meðan á CNCC lagskiptingu stendur eru umritunarþættir (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) og utanfrumu fylkis (ECM) endurgerð prótein eins og matrix metalloproteinasar (MMPs), hins vegar eru CNCCs beinir frumubeinakerfi AJ eftirlitsaðilar. ekki vitað enn.Vitað er að PI3K-AKT leiðin andmælir E-cadherin stigi, aðallega frá krabbameinsrannsóknum17.Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að tap á PDGFα-undirstaða PI3K-AKT merkjasendingar í músum leiðir til höfuðbeinagalla, þar með talið klofinn góms og taugagangagalla12.Hins vegar er sambandið á milli PI3K-AKT leiðarinnar og AJ stöðugleika við CNCC lagskiptingu óljóst.
Við greindum áður SPECC1L sem fyrsta stökkbreytta genið í tveimur einstaklingum með alvarlegan klof sem nær frá munni að auga, þekktur sem oblique cleft (ObFC) eða Tessier IV18 klofning.SPECC1L stökkbreytingar hafa verið greindar í tveimur fjölkynslóðafjölskyldum með autosomal dominant Opitz G/BBB heilkenni (OMIM #145410), þar sem sýktir einstaklingar sýndu oflanga fjarlægð og skarð í vör/góm19, og í einni fjölskyldu með Tibi oflengdarheilkenni (OMIM #145420)20 .meira en helmingur tilfella af Opitz G/BBB heilkenni er X-tengd (OMIM #300000) og orsakast af stökkbreytingum í MID1 geninu, sem kóðar prótein 22 í beinagrindinni í örpíplum tengdum frumum.Við gerum ráð fyrir að SPECC1L, einnig prótein tengt örpíplum og aktín umfrymi, geti miðlað merkjum sem þarf til að endurmóta aktín frumubeinagrind meðan á viðloðun og flutningi frumna stendur 18 .Með in vitro og in vivo rannsóknum lýsum við nú SPECC1L sem nýjum eftirlitsstofni AJ stöðugleika með PI3K-AKT merkjum.Á frumustigi leiddi skortur á SPECC1L til lækkunar á magni pan-AKT próteins og aukningar á apical-basal dreifingu AJ, sem var útrýmt með efnavirkjun á AKT ferlinu.In vivo sýna fósturvísar sem skortir eru Specc11 skerta lokun taugaslöngunnar og skerta CNCC-krufningu.Þannig virkar SPECC1L í mjög stýrðum frumuviðloðun sem byggir á merkjum sem þarf fyrir eðlilega CNCC virkni við formgerð andlits.
Til að lýsa hlutverki SPECC1L á frumustigi notuðum við áður lýst stöðugri beinsarkmeinfrumulínu U2OS sem skortir SPECC1L18.Þessar stöðugu U2OS frumur með SPECC1L (kd) niðurfellingu höfðu miðlungs (60–70%) lækkun á magni SPECC1L umrita og próteina, ásamt göllum í flutningi og endurskipulagningu á aktín umfrymi 18. Aftur á móti, alvarleg tímabundin lækkun á Sýnt hefur verið fram á að SPECC1L leiði til mítótískra galla 23 .Við frekari lýsingu komumst við að því að stöðugu SPECC1L-kd frumurnar okkar breyttu formgerð við mjög mikla samruna (mynd 1).Einstakar stjórnfrumur og kd frumur við lágt samrennsli litu svipað út (Mynd 1A, D).24 klukkustundum eftir samruna héldu viðmiðunarfrumur kubbaformi sínu (mynd 1B, E), en SPECC1L-kd frumur lengdust (mynd 1C, F).Umfang þessarar breytinga á lögun frumna var fangað með in vivo lifandi myndgreiningu af stjórnfrumum og kd frumum (mynd 1).Til að ákvarða hlutverk SPECC1L í samrennandi frumum skoðuðum við fyrst tjáningu þess.Við komumst að því að SPECC1L próteinmagn jókst við samruna (Mynd 1G), en SPECC1L umritsmagn jókst ekki (Mynd 1H).Þar að auki, þegar frumuþéttleiki jókst, safnaðist SPECC1L prótein við millifrumumörk (Mynd 2A-E), með mynstur sem skarast við það sem himnutengt β-catenin (Mynd 2A'-E').Í ljósi tengsla SPECC1L við aktín umfrymisbeinagrindina 18,23 gerðum við tilgátu um að SPECC1L hafi samskipti við aktín-undirstaða límmót (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) frumur lengjast við mikla samruna (F) samanborið við U2OS viðmiðunarfrumur (AC).Hér eru sýndir þrír af sex tímapunktum (T1, T3, T6) sem við völdum fyrir mismunandi frumuþéttleika.(G) Western blot greining sem sýnir að SPECC1L próteinið er stöðugt við mikla samrennsli samanborið við lága samruna í samanburðarfrumum.Western blot af SPECC1L sýnir væntanlegt 120 kDa band og band með hærri mólþunga, hugsanlega breytt eftir þýðingu (*).Western blot greining var gerð við sömu skilyrði fyrir lágt og mikið samrennsli.Myndir sem sýndu SPECC1L við lágt og mikið samfall voru teknar úr sama bletti.Sama bletturinn var fjarlægður og endurskoðaður með β-aktín mótefni.(H) Megindleg RT-PCR greining sýndi engar marktækar breytingar á styrk SPECC1L afrita.Villustikur tákna SEM frá fjórum sjálfstæðum tilraunum.
(AE) Við völdum sex tímapunkta (T1-T6) sem tákna fjölda frumuþéttleika til að staðla frumuformgreiningu og AJ breytingar í U2OS frumum með SPECC1L knockdown (kd).Fyrstu fimm þessara tímapunkta innihéldu stakar frumur (T1), 50-70% samruna smáfrumuþyrpinga (T2), samruna án þess að endurmóta kd frumur (T3), endurmótun kd frumna (T4) og 24 klst breytingar.í aftari formi kd (T5) frumna.SPECC1L próteinið var aðallega dreift í umfryminu við T1 (A), en uppsöfnun þess sást við millifrumumörk á síðari tímapunktum (B–E, örvar).(FJ) β-catenin sýnir svipaða uppsöfnun á millifrumumörkum í tengslum við AJ flókið.(A'-E') SPECC1L og β-catenin sýna litun sem skarast á frumumörkum við háan frumuþéttleika (örvar).(F'-J') Í SPECC1L-kd frumum virðist β-catenin litun eðlileg við lágan frumuþéttleika (F'-H'), en stækkar þegar lögun frumna breytist (I', J'; örvar), sem gefur til kynna að AJ hafa breyst.Slár = 10 µm.
Við reyndum síðan að ákvarða áhrif SPECC1L skorts á AJ.Við notuðum nokkur AJ-tengd merki, þar á meðal kanónísku þættina F-aktín, myosin IIb, β-catenin og E-cadherin24,25,26,27.Aktín streituþræðir jukust í SPECC1L-kd frumum eins og áður hefur verið lýst (Mynd 3A,B) 18 .Myosin IIb tengd aktínþráðum sýndi svipaða aukningu á SPECC1L-kd frumum in vitro (mynd 3C, D).AJ-tengt β-catenin binst kadheríni í frumuhimnunni, sem sýnir eðlilegt "honeycomb" tjáningarmynstur í stjórnkubrumum (mynd 3E, G).Athyglisvert er að í flötum myndum með confocal smásjá sýndu β-catenin (Mynd 3E,F) og E-cadherin (Mynd 3G,H) litun á frumuhimnu samrennandi SPECC1L-skorts frumna áberandi mynstur langvarandi litunar.Þessi stækkun á AJ-tengdri β-catenin litun í kd frumum var mest áberandi við samruna, en virtist vera á undan breytingum á lögun frumna (mynd 2F-J, F'-J').Til að ákvarða eðlisfræðilegt eðli þessarar útbreiddu AJ litunar, skoðuðum við frumumörk á apical-basal yfirborði SPECC1L-kd U2OS frumna með rafeindasmásjá (TEM) (Mynd 3I, J).Öfugt við stjórnfrumur (Mynd 3I), sem höfðu aðskilin rafeindaþétt svæði sem benda til AJ (örvar), sýndu kd frumur (Mynd 3J) stór, samliggjandi svæði með mikilli rafeindaþéttleika sem bendir til AJ meðfram apicobasal planinu..Að auki, á þversniðum, sáum við miklar frumuhimnufellingar í kd frumum (mynd S1A, B), sem útskýrir útvíkkað mynstur β-catenin og E-cadherin litunarbanda (mynd 3F, H).Til stuðnings hlutverki SPECC1L í AJs, var β-catenin sam-ónæmisútfellt með SPECC1L í lýsum af samrennandi U2OS frumum (mynd 3K).Samhliða framlengdri ónæmislitun fyrir AJ merkja var TEM greining í samræmi við tilgátu okkar um að SPECC1L skortur eykur AJ apical-basal þéttleika og dreifni.
(AH) Aukin F-aktín litun í kd frumum 48 klukkustundum eftir samruna (T6; A, B).Breytt litun á myosin IIb í tengslum við F-aktín (C, D).Slétt mynstur β-catenin og E-cadherin himnulitunar í samanburðarfrumum (E, G) var aukið í SPECC1L-kd (F, H) frumum.Slár = 10 µm.(I-J) Rafeindasmámyndir sem fylgjast með apical-basal millifrumumótum.Stjórnarfrumur sýna aðgreind rafeindaþétt svæði sem gefa til kynna límmót (I, örvar).Aftur á móti virtust öll apical-basal tengingin í SPECC1L-kd frumum rafeindaþétt (J, örvar), sem gefur til kynna aukinn þéttleika og dreifingu límmóta.(K) β-catenin var sam-ónæmisútfellt með SPECC1L í samrennandi U2OS frumulýsum.Mynd tekin frá einum stað sem táknar eina af fjórum sjálfstæðum tilraunum.
Til að skilja hlutverk SPECC1L í höfuðbeinamyndun, bjuggum við til Specc1l skort músarlíkan með því að nota tvær sjálfstæðar ES gildru frumulínur, DTM096 og RRH048 (BayGenomics, CA), sem tákna intron 1 og Specc1l afrit voru tekin við 15 (mynd 1). .4A, mynd S2).Erfðafræðileg staðsetning tálbeygjuinnskotsins var ákvörðuð með raðgreiningu í heilu erfðamengi og staðfest með PCR (mynd S2).Báðar genagildruhönnunin leyfðu einnig samruna Specc11-lacZ fréttamanna í ramma við töku.Þess vegna var lacZ tjáning ákvörðuð með X-gal litun notuð sem vísbending um Specc11 tjáningu.Báðar samsæturnar sýndu svipað lacZ tjáningarmynstur, þar sem DTM096 genagildran í intron 1 sýndi sterkari tjáningu en RRH048 í intron 15 (ekki sýnt).Hins vegar er Specc1l víða tjáð, með sérstaklega sterkri tjáningu í taugafellingum við E8.5 (Mynd 4B), í taugaslöngu og andlitsferlum við E9.5 og E10.5 (Mynd 4C,D) og í útlimum sem eru að þróast. við E10.5 og augu (Mynd 4D).Við greindum áður frá því að SPECC1L tjáning í fyrsta kokboganum við E10.5 væri til staðar í þekjuvef og undirliggjandi mesenchyme18, í samræmi við CNCC ætterni.Til að prófa SPECC1L tjáningu í CNCC, gerðum við E8.5 taugafellingar (Mynd 4E-J) og E9.5 höfuðkúpuhluta (Mynd 4K-).Á E8.5, SPECC1L lituð taugafellingar ákaflega (mynd 4E, H), þar á meðal frumur litaðar með NCC merkjum (mynd 4G, J).Á E9.5, SPECC1L (Mynd. 4K, N) sterklega litað migrating CNCC co-lituð með AP2A (Mynd. 4L, M) eða SOX10 (Mynd. 4O, P).
(A) Skýringarmynd af músinni Specc11 geninu sem sýnir innsetningu tálvekurs í ES DTM096 (intron 1) og RRH048 (intron 15) frumuklónum.(BD) lacZ litun á arfblendnum Specc1lDTM096 fósturvísum sem tákna Specc1l tjáningu frá E8.5 til E10.5.NE = neuroectoderm, NF = taugafell, PA1 = fyrsti kokbogi.(EP) SPECC1L ónæmislitun með NCC merkjum AP2A og SOX10 í E8.5 (NF; EJ) taugafellingum og E9.5 (KP) höfuðkúpuhlutum.SPECC1L litun sást víða í taugafellingum E8.5 (E, H; örvahausar), þar á meðal frumur merktar með AP2A (F, G; örvaroddur) og SOX10 (I, J; örvahausar).Á E9.5, SPECC1L sterklega lituð flótta CNCCs (K, N; örvar) merkt AP2A (L, M; örvar) og SOX10 (O, P; örvar).
Kross á milli arfblendna Specc1lDTM096/+ og Specc1lRRH048/+ músa sýnir að genagildrusamsæturnar tvær eru ekki samsettar og að samsettar arfblendnar og fósturvísa arfblendnar fyrir hvora genagildrusamsætuna eru fósturvísa banvænar (tafla S1).Mendelian hlutföll bentu til lækkunar á lifunartíðni arfblendna við fæðingu (búist við 1,34 á móti 2,0).Við bentum á lágan burðarmálsdauða meðal arfblendna, sumir höfðu höfuðbeina frávik (mynd S3).Hins vegar, lítil skarpskyggni þessara burðarmáls höfuðbeinasvipgerða gerir það erfitt að rannsaka undirliggjandi meinalífeðlisfræðilega fyrirkomulag þeirra.Þess vegna lögðum við áherslu á fósturvísa banvæna svipgerð arfhreinra Specc11 stökkbrigði.
Flestir samsettir arfblendnir eða arfhreinir Specc1lDTM096/RRH048 stökkbreyttir fósturvísar þróuðust ekki eftir E9.5–10.5 (myndir 5A–D) og taugarörið lokaðist ekki að framan (myndir 5B, D) og lokaðist stundum að aftan (ekki sýnt) ..Þessi galli á lokun höfuðkúptaugapípunnar tengdist meirihluta CNCC merkt DLX2 eftir í taugafellingum við E10.5, sem gefur til kynna að engin krufning sé (Mynd 5A'-D').Til að ákvarða hvort heildarstærð CNCC væri einnig minnkuð, merktum við CNCC línur með GFP í genagildrulínum okkar með Wnt1-Cre og ROSAmTmG.Við streymum flokkuðum GFP+ NCC og GFP- (RFP+) non-NCC frá heilum fósturvísum.Við E9.5 breyttist hlutfall flæðisflokkaðra GFP-merktra CNCCs ekki marktækt milli WT og stökkbreyttra fósturvísa (ekki sýnt), sem gefur til kynna eðlilega CNCC forskrift.Þess vegna gerðum við tilgátu um að leifar af Wnt1-Cre og DLX2 litun í útsettum taugafellingum (Mynd 5B') væri vegna gölluðs CNCC lagskiptunar, hugsanlega vegna aukinnar þéttleika eða dreifingar AJ frumna, eins og sést í SPECC1L-kd frumum.Við notuðum NCC merkin SOX10, AP2A og DLX2 til að staðfesta tilvist CNCC í taugafellingunni (Mynd 5E-R).Við E8.5 sást taugafella litun fyrir öll þrjú NCC merkin í köflum WT (mynd 5E, G, I) og Specc1l stökkbrigði (mynd 5F, H, J).Á E9.5, á meðan NCC merki lituðu fljúgandi NCC í WT köflum (mynd 5M, O, Q), sást leifar af NCC litun í útsettum taugafellingum af Specc1l stökkbreyttum fósturvísum (mynd 5N, P, R).Vegna þess að SOX10 og DLX2 merkja flutning CNCC, bendir þessi niðurstaða til þess að SPECC1L-skortur CNCCs nái forskrift eftir flutning en tekst ekki að flytja úr taugafellingum.
Skortur á Specc11 leiðir til gallaðrar lokun taugaslöngunnar, delamination á höfuðkúputaugakamafrumum og AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Fósturvísa sem ber flytjandi höfuðkúputaugakambfrumur (CNCC) merktar með Wnt1-Cre (A').Aftur á móti sýna Specc11 stökkbreytt fósturvísar opna taugafellingar (B), örvahausa og CNCC sem hafa ekki flust til (B', örvahausar).(C, D') Ljósmyndir (C, D') og ónæmislitun (C', D') á CNCC merkinu DLX2 af E10.5 WT fósturvísum (C, C') og Specc1l (D, D').Í WT E10.5 fósturvísum, DLX2-jákvæðir CNCC landvistar tálknabogana (C', örvar), en hjá stökkbreyttum er áberandi litun viðvarandi í opnum taugafellingum (D', örvar) og í fyrstu kokbogunum (D', örvar).) með smá litun (örvar) sem gefur til kynna lélega delamination og flæði CNCC.ER) Hlutar af WT og Specc1l stökkbreyttum fósturvísum á stigum E8.5 (E–L) og E9.5 (M–R) voru merktir með NCC merkjum SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) og DLX2 (I, J, Q, R).Við E8.5 sást NCC litun í villtum taugafellingum (NF) og stökkbreyttum hlutum.Samlitun á SOX10 og β-catenin í E8.5 WT (K) og stökkbreyttum (L) leiddi í ljós aukna β-catenin litun við frumumörk í taugafellingum.Við E9.5 sást villigerð litun á CNCC á flótta (M, O, Q) en hjá stökkbreyttum lituðu ólagskipt CNCC opna taugafellingar (N, P, R).(S-Z) In vivo AJ merkingargreining í kransæðaköflum WT og Specc11DTM096/RRH048 fósturvísa með E9.5 stökkbreytingunni.Áætlað skurðarplan er sýnt í efra hægra horninu.Í köflum stökkbreyttra vefja kom fram aukin litun á F-aktíni (S, T) og mýósíni IIb (U, V).Svipað og in vitro niðurstöðurnar á mynd 3, í stökkbreyttum fósturvísum, sást aukin himnulitun fyrir β-catenin (W, X) og E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) Rafeindasmámynd af hluta villtgerðarfósturvísis sem horfir út fyrir mörk apical-basal frumunnar sýnir sérstakt rafeindaþétt svæði sem gefur til kynna límmót (AA, örvar).Aftur á móti, í köflum af Specc11 stökkbreyttum fósturvísum (BB, örvar), er allt apicobasal tengið rafeindaþétt, sem gefur til kynna aukinn þéttleika og dreifingu límmóta.
Til að prófa tilgátu okkar um að minni lagskipting sé vegna breytts AJ, skoðuðum við AJ merkingu í útsettum taugafellingum Specc1l stökkbreyttra fósturvísa (mynd 5S-Z).Við sáum aukningu á aktín streituþráðum (mynd 5S, T) og samhliða aukinni staðsetningu myosin IIB litunar á aktín trefjum (mynd 5U, V).Mikilvægt er að við sáum aukna litun á β-catenin (mynd 5W, X) og E-cadherin (mynd 5Y, Z) á millifrumumörkum.Við skoðuðum einnig β-catenin litun á NCC í taugafellingum E8.5 fósturvísa (mynd 5K, L).β-catenin litun virtist vera sterkari í Specc1l stökkbreyttum taugafellingum (mynd 5L og K), sem bendir til þess að AJ breytingar hafi hafist.Í rafeindasmámyndum af höfuðkúpuhlutum af E9.5 fósturvísum, sáum við aftur aukna dreifða rafeindaþétta litun í Specc1l stökkbreyttum fósturvísum samanborið við WT (mynd 5AA, BB og S1E-H).Samanlagt styðja þessar niðurstöður in vitro niðurstöður okkar í SPECC1L-kd U2OS frumum og benda til þess að afbrigðileg AJ litun komi á undan CNCC lagskiptingu í stökkbreyttum fósturvísum okkar.
Í ljósi þekktra andstæðinga sambandsins milli AKT virkni og E-cadherin stöðugleika, 17,28 gerðum við tilgátu um þátttöku PI3K-AKT merkja.Að auki sáum við undirþekjublöðrumyndun í sumum stökkbreyttra fósturvísa okkar sem sluppu við dauða (<5%) við E9.5-10.5 og settust í staðinn í kringum E13.5 (mynd S3).Blöðrur undir húð eru einkenni minnkuðra PI3K-AKT boðefna sem byggjast á PDGFRα12.Fantauzzo o.fl.(2014) greint frá því að truflun á PDGFRα-byggðri PI3K virkjun í PdgfraPI3K/PI3K stökkbreyttum fósturvísum leiði til blöðrur undir húðþekju, taugagangagalla og svipgerða gómsklofa.Reyndar var magn pan-AKT og virks fosfórýleraðs Ser473-AKT minnkað in vivo í Specc1l stökkbreyttum vefjum í E9.5 fósturstöðvun (mynd 6A-D).Minnkun á magni fosfórýleraðs Ser473-AKT getur alfarið verið vegna lækkunar á magni pan-AKT in vivo (Mynd 6E) og in vitro (Mynd 6F).In vitro lækkun sást aðeins þegar U2OS frumur voru mjög samfleyttar með breytingum á frumulögun og AJ þéttleika (Mynd 6D).Þannig benda gögn okkar til þess að SPECC1L sé nýr jákvæður eftirlitsaðili PI3K-AKT merkja í höfuðkúpu og andliti.
(A–E) E8.5 (A,B) og E9.5 (C,D) höfuðkúpuhlutar eða E9.5 lýsöt úr Specc1l stökkbreyttum fósturvísum (E) sem sýna magn virks fosfórýleraðs S473-AKT og pan-AKT próteinminnkunar , samanborið við stjórn WT.Western blotting var framkvæmd á villigerð lýsum og stökkbreyttum lýsum við sömu aðstæður.Myndirnar sem sýndar voru fyrir SPECC1L voru teknar úr einum bletti.Sama bletturinn var fjarlægður og endurskoðaður með and-pan-ACT og β-actin mótefnum.Pan-AKT gildi í E8.5 taugafellingum (A, B) og magn fosfórýleraðs S473-AKT í E9.5 höfuðkúpuhlutum voru marktæk minnkuð.(F) Pan-AKT magn minnkaði á sama hátt í lýsum af SPECC1L-kd U2OS frumum sem safnað var við mikla samruna.Villustikur tákna SEM frá þremur sjálfstæðum Western blot magngreiningum.(GJ) Hlutar af WT fósturvísum við E9.5 litaðir með KI67 og klofnum kaspasa 3, í sömu röð, sem sýna frumufjölgun (G, G') og litla apoptotic virkni (H, H').Specc11 stökkbreyttir fósturvísar sýna sambærilega frumufjölgun (I), en fjöldi frumna sem gangast undir frumudauða er verulega aukinn (J).
Við skoðuðum síðan merki um fjölgun og frumudauða.Við sáum engan mun á fjölgun E9.5 fósturvísa (mynd 6E, G samanborið við I) með útbreiðslustuðul upp á 82,5% fyrir WT stökkbrigði og 86,5% fyrir Specc1l stökkbrigði mælt með KI67 litun (p <0,56, Fisher's nákvæm próf).Að sama skapi sáum við engan mun á frumudauða mældum með litun á klofnum kaspasa 3 í taugafellingum við E8.5 þar til fósturvísastopp (ekki sýnt) (ekki sýnt).Aftur á móti jókst apoptosis marktækt í öllum E9.5 stökkbreyttum fósturvísum (mynd 6F, H og J).Þessi heildaraukning á frumudauða er í samræmi við minni PI3K-AKT merkjasendingar og snemmbúna dauða fósturvísa29,30,31.
Næst, til að staðfesta orsakahlutverk PI3K-AKT merkja í AJ breytingum í kd frumum okkar, breyttum við efnafræðilega leiðinni í stjórn og kd frumum (Mynd 7A-F).Við notuðum sem merki frumuformbreytinguna sem sést í samrennandi SPECC1L-kd frumum, sem við töluðum með því að nota hlutfall lengstu víddar (lengd) og samsvarandi lóðréttu víddar (breidd).Búist er við að hlutfallið 1 sé 1 fyrir tiltölulega kringlóttar eða kubískar frumur (Mynd 7G).Til viðbótar við frumulögun, staðfestum við einnig áhrif á AJ með β-catenin litun (Mynd 7A'-F').Hömlun á PI3K-AKT leiðinni með því að nota wortmannin var nægjanleg til að breyta frumulögun í samanburðarfrumum (Mynd 7A,C) og AJ (Mynd 7A').PI3K-AKT virkjarinn SC-79 hafði ekki áhrif á lögun frumna (Mynd 7A, E) eða AJ stækkun (Mynd 7A') í samanburðarfrumum.Í SPECC1L-kd frumum leiddi frekari bæling á PI3K-AKT leið til aukinnar frumudauða (mynd 7B, D) og marktækrar aukningar á β-catenin litun (mynd 7B '), í samræmi við in vivo þungar stökkbrigði okkar.Mikilvægt er að virkjun PI3K-AKT leiðarinnar bætti verulega frumuform (Mynd 7B,F) og AJ svipgerð (Mynd 7B").Breytingar á frumulögun voru magngreindar sem kringlunarhlutfall frumna (CCR) og borið saman með tilliti til þýðingar eins og lýst er hér að ofan (Mynd 7G).Reyndar, í samanburðarfrumum (mynd 7G, CCR = 1,56), var meðferð með wortmannin nægjanleg til að breyta lögun frumunnar marktækt (Mynd 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) að því marki sem er svipað því sem sést hefur. í SPECC1L.-kd frumur (mynd 7G, CCR = 3,46).Wortmannin meðferð á SPECC1L-kd frumum (mynd 7G, CCR = 3,60, hverfandi) var ekki marktækari en ómeðhöndlaðar kd frumur (Mynd 7G, CCR = 3,46, hverfandi) eða wortmannin-meðhöndlaðar samanburðarfrumur (Mynd 7G)., CCR = 3,46, hverfandi) hefur að auki áhrif á lengingu frumna (7G, CCR = 3,61, hverfandi).Mikilvægast er að SC-79 AKT virkja endurheimti ílanga svipgerð SPECC1L-kd frumna (Mynd 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Þessar niðurstöður staðfesta að SPECC1L stjórnar PI3K-AKT merkjum og benda til þess að miðlungs lækkun á SPECC1L hafi áhrif á viðloðun frumna, en mikil lækkun leiðir til frumudauða (mynd 8).
(A–F') Stýrifrumur (A, C, E) og SPECC1L-kd (B, D, F) meðhöndlaðar með PI3K-AKT ferli hemli wortmannin (C, D) eða SC-79 virkja (E, F) meðferð .Ómeðhöndlaðar samanburðarfrumur eru kubbalaga (A) með eðlilegri β-cat frumulitun (A'), en kd frumur eru lengdar (B) með aukinni β-cat litun (B').Eftir bælingu á PI3K-AKT ferlinum lengdust stjórnfrumur (C) með β-cat stækkun (C'), á meðan kd frumur fóru að gangast undir apoptosis (D), svipað og mjög stökkbreytt fósturvísa okkar og sýna afar aukna β-cat.litun (D').Eftir virkjun PI3K-AKT ferilsins héldust viðmiðunarfrumur kubbalaga (E) og höfðu eðlilega β-cat (E') litun, en kd frumur sýndu marktækt bætta frumulögun (F) og β-cat (F') litun, sem gefur til kynna (G) Stig frumulögunarbreytingar í (AF) var magnmælt með því að nota hringhringshlutfall frumna (CCR) lengstu víddarinnar (lengd) og samsvarandi lóðréttrar víddar (breiddar) með MetaMorph hugbúnaði.Ómeðhöndlaðar (NT) SPECC1L-kd frumur (CCR = 3,46) voru marktækt lengri en samanburðarfrumur (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10-13).Hömlun Worts á PI3K-AKT ferli í samanburðarfrumum var nægjanleg til að valda svipaðri lengingu í frumuformi (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Á sama hátt endurheimti AKT virkjun með SC-79 í SPECC1L-kd frumum lenging frumna í stjórnstig (CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Wortmannin meðferð á SPECC1L-kd frumum leiddi til aukinnar frumudauða en ekki frekari aukningar á frumulögunarbreytingu (CCR=3,60) samanborið við ómeðhöndlaðar kd (CCR=3,46, ns) eða wortmanninmeðhöndlaðar samanburðarfrumur (3,61) sem sáust í .ns = skiptir ekki máli.+/- SEM mælingar fyrir 50 frumur eru sýndar.Tölfræðilegur munur var reiknaður út með t-prófi nemenda.
(A) Skýringarmynd á hömlun og virkjun PI3K-AKT leiðarinnar sem leiðir til AJ breytingar og björgun, í sömu röð.(B) Fyrirhugað líkan fyrir AKT próteinstöðugleika með SPECC1L.
Premigratory CNCCs krefjast AJ lýsu til að aðskiljast frá fremri taugafellinga taugaþekjufrumum1,15,32.Aukin litun á AJ efnisþáttum og tap á apical-basal AJ ósamhverfu dreifingu í frumum sem skortir SPECC1L bæði in vitro og in vivo, ásamt líkamlegri nálægð SPECC1L við β-catenin, bendir til þess að SPECC1L virki til að viðhalda AJ staðbundnum stöðugleika skipulagsvöðvar.aktín frumubeinagrind.Tengsl SPECC1L við aktín frumubeinagrind og β-catenin og aukning á fjölda þéttra aktínþráða í fjarveru SPECC1L er í samræmi við aukningu á AJ þéttleika.Annar möguleiki er að aukinn fjöldi aktíntrefja í frumum sem skortir SPECC1L leiði til breytinga á millifrumuspennu.Vegna þess að frumuálag hefur áhrif á gangverki AJ 33, geta spennubreytingar leitt til dreifðari AJ 34.Þannig að allar breytingar munu hafa áhrif á CNCC lögin.
Wnt1 er tjáð í fyrstu taugafellingum sem gefa af sér taugafrumur.Þannig merkir Wnt1-cre ættkvísl rekja bæði fyrir og flytja NCC35.Hins vegar merkir Wnt1 einnig klóna á bakheilavef sem einnig eru unnin úr snemma taugafellingum 35,36, sem gerir það líklegt að litun okkar á E9.5 stökkbreyttum fyrir Wnt1 merkjum í opnum taugafellingum sé ekki CNCC.Jákvæð litun okkar fyrir NCC merkin AP2A og SOX10 staðfesti að útsettir taugafellingar Specc11 stökkbreyttra fósturvísa innihéldu sannarlega CNCC.Þar að auki, þar sem AP2A og SOX10 eru merki um snemmbúna flutning NCC, gaf jákvæð litun til kynna að þessar frumur séu CNCC eftir flutning sem ekki er hægt að lagskipta með E9.5.
Gögn okkar benda til þess að sameindastjórnun AJ með SPECC1L sé miðlað af PI3K-AKT merkjum.AKT boð eru minni í frumum og vefjum sem skortir SPECC1L.Niðurstöður Fantauzzo o.fl.styðja beint hlutverk PI3K-AKT boðefna í höfuðbeinamyndun.(2014) sýndu að skortur á virkjun PDGFRα-undirstaða PI3K-AKT merkja leiðir til klofinn svipgerð.Við sýnum einnig að hömlun á PI3K-AKT ferli er nægjanleg til að breyta AJ og frumuformi í U2OS frumum.Í samræmi við niðurstöður okkar, Cain o.fl.37 sýndi að niðurstýring á PI3K α110 undireiningunni í æðaþelsfrumum leiðir til svipaðrar aukningar á pericellular β-catenin litun, sem vísað er til sem hækkun á „tengingarvísitölu“.Hins vegar, í æðaþelsfrumum þar sem aktínþræðir eru þegar mjög skipulagðir, leiðir bæling PI3K-AKT ferilsins í lausa frumuform.Aftur á móti sýndu SPECC1L-kd U2OS frumur ílanga frumuform.Þessi munur getur verið frumutegundarsértækur.Þó að bæling PI3K-AKT merkja hafi varanlega áhrif á aktín frumubeinagrindina, ákvarðast áhrifin á lögun frumna af breytingum á spennu sem stafar af breytingum á þéttleika og skipulagi miðlægra aktínþráða.Í U2OS frumum notuðum við aðeins breytingar á frumuformi sem merki um SPECC1L-skort AJ breytingu og bata.Að lokum gerum við þá tilgátu að hömlun á AKT leið í SPECC1L skort eykur AJ stöðugleika og dregur úr delamination í CNCC.
Athyglisvert er að magn pan-AKT lækkuðu in vitro og in vivo auk fosfórýleraðs 473-AKT magns í fjarveru SPECC1L, sem bendir til stjórnun PI3K-AKT boðefna á stigi AKT próteinstöðugleika eða veltu.SPECC1L og MID1 genin, bæði tengd Opitz/GBBB heilkenni, kóða prótein sem koma á stöðugleika í örpíplum 18,22.Ekki er fullkomlega skilið hvernig SPECC1L og MID1 miðla stöðugleika örpípla.Þegar um SPECC1L er að ræða felur þessi stöðugleiki í sér aukna asetýleringu á undirmengi örpípla 18 .Það er mögulegt að SPECC1L noti svipaðan gang til að koma á stöðugleika á önnur prótein eins og AKT.Sýnt hefur verið fram á að asetýlering lýsínleifa í AKT próteininu leiðir til minnkunar á himnustaðsetningu og fosfórýleringu38.Auk þess er þörf á ubiquitination á K63 keðjunni við sömu lýsínleifar á AKT fyrir himnustaðsetningu og virkjun hennar39,40.Meðal nokkurra þátta sem hafa víxlverkun við SPECC1L prótein sem greind eru í ýmsum tveggja-blendinga skjáum með mikilli afköst ger, hafa fjórir – CCDC841, ECM2942, APC og UBE2I43 – verið bendlaðir við próteinveltu eða stöðugleika með ubiquitination eða sumoylering.SPECC1L getur tekið þátt í breytingum á AKT lýsínleifum eftir þýðingu, sem hefur áhrif á AKT stöðugleika.Hins vegar á enn eftir að skýra mikilvæga hlutverk SPECC1L í staðsetningu og stöðugleika AKT próteins.
Alvarlegir gallar í tjáningu SPECC1L in vivo leiddu til aukinnar litunar á AJ merkja og gallaðrar CNCC yfirborðs, auk aukinnar frumudauða og snemma fósturlátsdauða.Fyrri skýrslur hafa sýnt að stökkbrigði í músum með aukið magn frumudauða tengist taugagangagalla 44,45,46,47 og höfuðbeinagalla48.Því hefur verið haldið fram að of mikill frumudauði í taugafellingum eða kokbogum geti leitt til ófullnægjandi fjölda frumna sem þarf fyrir rétta formgerða hreyfingu 48,49,50.Aftur á móti sýndu SPECC1L-skortur frumulínur okkar með í meðallagi skertri SPECC1L tjáningu aðeins AJ breytingar án vísbendinga um aukinn frumudauða.Hins vegar leiddi efnafræðileg hömlun á PI3K-AKT leiðinni í þessum Kd frumum til aukinnar frumudauða.Þannig tryggir hófleg lækkun á tjáningu eða virkni SPECC1L frumulifun.Þetta er í samræmi við þá athugun að sjaldgæf Specc11 stökkbreytt fósturvísa sem sleppa við handtöku á St.E9.5-kannski vegna minni genafanga skilvirkni-geta lokað taugaslöngur þeirra og stöðva síðar í þróun, oft með höfuðbeinagalla (Mynd S3).Einnig í samræmi við þetta er sjaldgæft tilvik arfblendinna Specc1l fósturvísa með höfuðbeinagalla - líklega vegna aukinnar genafangavirkni - sem og uppgötvunin í sebrafiskum þar sem annar af tveimur SPECC1L réttstöðulyfjum (specc1lb) veldur síðbúnum svipgerðum fósturvísa, þ.m.t. neðri kjálkar og tvíhliða klofnar51.Þannig geta arfblendnar SPECC1L stökkbreytingar með tap á virkni sem greinst hafa hjá sjúklingum í mönnum valdið lítilli skerðingu á starfsemi SPECC1L meðan á höfuðbeinamyndun stendur, sem nægir til að skýra munnholsklofin þeirra.SPECC1L-undirstaða stjórnun á millifrumu snertingum getur einnig gegnt hlutverki í gómmyndun og samruna kokboga.Frekari rannsóknir á virkni SPECC1L munu hjálpa til við að skýra hlutverk tímabundinna millifrumusambanda í CNCC við lokun taugaslöngunnar í hreyfanleika taugaþekjufrumna og höfuðkúpu og andlitsmyndun.
U2OS beinsarkmeinsstjórnun og SPECC1L-kd frumum hefur verið lýst áður (Saadi o.fl., 2011).Mótefni gegn SPECC1L hafa einnig verið einkennd áður (Saadi o.fl., 2011).And-β-catenin mótefni (kanína; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mús; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kaliforníu), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), klofinn kaspasi 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) og β-aktín (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) var notað eins og lýst er..Aktínþræðir voru litaðir með Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS viðmiðunarfrumur og SPECC1L-kd frumur voru ræktaðar í venjulegu háglúkósa DMEM ásamt 10% fóstursermi úr nautgripum (Life Technologies, Carlsbad, CA).Fyrir AJ breytingar voru 2 x 105 frumur sáð á gler sem var meðhöndlað með 0,1% svínagelatíni (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og fylgst með breytingum á frumuformi.Frumum var safnað á mismunandi tilgreindum tímapunktum: 4 klukkustundum eftir sáningu (t = 1), 24 klukkustundum eftir sáningu (t = 2), samruna án breytinga á lögun frumna (t = 3), breyting á lögun frumu (t = 4) , 24 klst. eftir frumulögunarbreytingu (t = 5) og 48 klst. eftir frumulögunarbreytingu (t = 6) (mynd 1, 2, 3).Til að móta PI3K-AKT ferlið voru frumur ræktaðar í tilgreindum styrk með PI3K-AKT hemlinum wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) eða SC-79 virkjana (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Skipt var um efnið sem inniheldur efnin daglega.
Ramma-fyrir-ramma upptökur voru gerðar á lifandi stýrifrumum og KD frumum við venjulegar ræktunaraðstæður og fasaskilamyndum var safnað á 10 mínútna fresti í 7 daga.Myndir voru teknar með því að nota tölvustýrða Leica DM IRB öfuga smásjá sem búin var vélrænu stigi og 10 × N-PLAN hlutlægu tengt við QImaging Retiga-SRV myndavél.Við myndgreiningu var frumurækt haldið við 37°C í röku andrúmslofti með 5% CO2.
Tvær genagildru ES frumulínur DTM096 og RRH048 frá Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) voru notaðar til að búa til Specc11 skort músalínur, tilnefndir Specc1lgtDTM096 og Specc1lgtRRH046.Í stuttu máli var 129/REJ ES frumum sprautað í C57BL6 blastocysts.Kímmýsnar sem mynduðust voru ræktaðar með kvenkyns C57BL6 músum til að bera kennsl á afkvæmi með agouti feldslit.Tilvist genagildruferjuinnsetninga var notuð til að bera kennsl á arfblendna.Músum var haldið á blönduðum bakgrunni 129/REJ;C57BL6.Staðsetning innsetningarstaðar erfðagildruferjunnar var staðfest með RT-PCR, erfðamengisraðgreiningu og erfðauppfyllingu (viðbótarmynd 1).Til að rekja CNCC ætterni tvöfaldra arfblendna Specc1lGT músa voru ROSAmTmG (#007576) og Wnt1-Cre (#003829) mýs (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) krossaðar til að framleiða ROSAmTmG og Wnt1-Cre samsætuna í Speccyol fósturvísi.Allar tilraunir á músum voru gerðar samkvæmt samskiptareglum sem samþykktar voru af dýraverndunar- og notkunarnefnd háskólans í Kansas læknamiðstöðinni.
Fósturvísar voru festir í (1% formaldehýð, 0,2% glútaraldehýð, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) í 60 mínútur við stofuhita.Eftir festingu í X-gal litunarlausn (5 mM kalíumferrísýaníð, 5 mM kalíumferrósýaníð, 2 mM MgCl2, 0,01% natríumdeoxýkólat, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Var litaþróun framkvæmd við 37°C .°C innan 1-6 klst.Fósturvísar voru eftirfixaðir í 4% PFA og sýndir.
Fyrir Western blotting voru frumur ljósaðar í óvirkri lýsisbuffi (Promega, Fitchburg, WI) bætt við blöndu af HALT próteasa hemlum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lýsöt voru unnin á 12% pólýakrýlamíð Mini-PROTEAN TGX tilbúnum hlaupum (Bio-Rad, Hercules, CA) og flutt yfir á Immobilon PVDF himnur (EMD Millipore, Billerica, MA).Himnurnar voru stíflaðar í 5% mjólk í PBS sem innihélt 0,1% Tween.Mótefni voru ræktuð yfir nótt við 4°C eða í eina klukkustund við stofuhita.Femto SuperSignal West ECL hvarfefni (Thermo Scientific, Waltham, MA) var notað til að mynda merkja.Fyrir ónæmislitun voru fósturvísar festir á einni nóttu í 4% PFA/PBS og frystaðir.Vefjaskurðir voru lokaðir í PBS sem innihélt 1% eðlilegt geitasermi (Thermo Scientific, Waltham, MA) og 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og síðan ræktað við 4°C í hitakassa meðan á nótt.með mótefni og flúrljómandi aukamótefni (1:1000) í 1 klukkustund við 4°C.Litaðir hlutar voru settir í ProLong gullmiðil (Thermo Scientific, Waltham MA) og flatar myndir voru fengnar með því að nota Leica TCS SPE confocal smásjá.Hver ónæmislitun var gerð sem þrjár sjálfstæðar tilraunir á þverskurði á að minnsta kosti tveimur stökkbreyttum fósturvísum.Sýnd er dæmigerð tilraun.
Frumur voru ræktaðar í breyttri RIPA jafnalausn (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glýseról, 2 mM EDTA og HALT próteasa hemill (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Í stuttu máli voru lysöt forhreinsuð með prótein G segulperlum (Life Technologies, Carlsbad, CA) og síðan ræktuð yfir nótt við 4°C. með and-SPECC1L eða IgG prótein G próteinperlum voru notaðar til að draga út SPECC1L og Western blotting var framkvæmd með því að nota andstæðinginn. -β-catenin mótefni sem lýst er hér að ofan. Co-IP tilraunirnar sem sýndar eru eru dæmigerðar fyrir fjórar sjálfstæðar tilraunir.
Föstum ræktuðum frumum eða músafósturvef var veitt rafeindasmásjárskoðunarmiðstöð við háskólann í Kansas læknastöðinni.Í stuttu máli voru sýni felld inn í EMbed 812 plastefni (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), fjölliðuð yfir nótt við 60°C og skipt í sneiðar við 80 nm með því að nota Leica UC7 ultramicrotome búin með demantsblaði.Hlutar voru sýndir með JEOL JEM-1400 rafeindasmásjá með 100 kV Lab6 byssu.
Hvernig á að vitna í þessa grein: Wilson, NR o.fl.Skortur á SPECC1L leiðir til aukins stöðugleika í splæstum liðum og minni delamination á höfuðkúputaugakamafrumum.vísindin.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Framleiðslu og aðgreining á taugakambi.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR o.fl.Höfuðtaugafrumur á hreyfingu: hlutverk þeirra í þróun höfuðbeina.American Journal of Medical Genetics.Part A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: vöxtur þess og þróun í 20 ár.Barnalæknir.meinafræði.rannsóknarstofu.lyf.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU og Noten MM Bylting í erfðafræði munnholsklofa.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. og Riley, FM Sameindaaðferðir á flutningi höfuðkúpu taugafrumna og mynstri við þróun höfuðbeina.Þróun 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH og Murray, JK. Slit vör og gómur: skilningur á erfða- og umhverfisáhrifum.eðlileg athugasemd.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR o.fl.Óeðlileg formgerð húðar, útlima og höfuðbeinasvæðis í músum sem skortir interferon-stýriþátt-6 (Irf6).National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. o.fl.Ríkjandi stökkbreytingar í GRHL3 valda van der Waord heilkenni og skerða þróun munnhols.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ og Juriloff, DM Uppfærðu listann yfir stökkbrigði í músum með galla í lokun taugaslöngunnar og framfarir í átt að fullkomnum erfðafræðilegum skilningi á lokun taugaslöngunnar.Rannsókn á fæðingargöllum.Part A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-miðluð PDGFRalpha merki stjórnar lifun og útbreiðslu í þróun beinagrindarinnar í gegnum p53-háða innanfrumuleið.Genþróun 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND og Murdoch, JN Disheveled: Tengsl samleitni stækkunar við lokun taugaröra.Stefna í taugafræði.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).